黑龙江地区154例非小细胞肺癌EGFR和K-ras基因突变的分析

中国人民解放军第211医院（150080）张怡 张倩

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，每年世界范围内因为肺癌死去的患者超过数百万，它无时无刻不在危害着人们的健康，因此对于肺癌的诊治一直是医学界不断关注的焦点[1]。肺癌患者中约有75%～85%属于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。传统治疗方法多为化疗和放疗，虽然取得了一定的治疗效果，但是同时也会给患者带来一定的副作用[2]。近年来随着细胞生物学的深入研究，医学界出现了继手术、化疗、放疗三大传统治疗又一重大的治疗方式，即分子生物靶向治疗[3]。因其针对各靶点的特异性进行精确地治疗，所以显著提高了肿瘤治疗的有效性，并且降低了治疗的不良反应，从而为NSCLC治疗带来了希望。

表皮生长因子受体EGFR是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的功能蛋白，临床上通常采用小分子EGFR细胞内酪氨酸激酶抑制剂（tyrosin kinase inhibitors，TKIs）来选择性抑制细胞内酪氨酸激酶的活化，它能够中断其下游的信号转导，从而阻止肿瘤的发生[4]。代表药物有吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）等，它们在晚期NSCLC的治疗中发挥了重要的作用。K-ras是EGFR信号传导通路中一个重要的下游调控基因，突变型的K-ras无需EGFR接受信号，能够自动活化该通路并启动下游信号的转导。因此，只有野生型K-ras基因的患者对EGFR-TKIs的治疗有效，而对于突变型K-ras基因的患者来说无效[5]。不仅如此，突变型的K-ras基因可以使患者对吉非替尼产生耐药性。在靶向治疗的过程中，由于使用的药物价格较昂贵，所以在用药前有效判断NSCLC患者对该药的敏感性就显得尤为重要[6]。

在本研究中，我们检测和分析我院非小细胞肺癌患者的EGFR、K-ras基因突变的情况，为临床的靶向用药治疗提供了重要的依据。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集我院2012～2015年间在我院肿瘤科、呼吸科和胸外科被诊治为非小细胞肺癌患者的血液标本，共计154例。选取154例非小细胞肺癌患者为研究对象。其中，男性患者84例（54.5%），女性患者70例（45.5%）。年龄为33～89岁，中位年龄为61岁。有吸烟史患者67例（43.5%），无吸烟史患者87例（56.5%）。患者病理类型为腺癌90例（58.4%），非腺癌64例（41.6%）。分别记录好患者的性别、年龄、吸烟史、病理类型等临床信息等。

1.2 基因组DNA的提取 对NSCLC患者标本采集后，进行标本的DNA提取。将患者的新鲜血液放置EDTA抗凝管中6h，待血浆析出后，将血浆吸至EP管中，连续离心3次，吸取上清液。按照说明，采用DNA提取试剂盒进行操作。DNA提取之后，对DNA进行浓度检测，将提取好的DNA样本于-20℃保存。

1.3 基因突变检测 基因突变检测采用实时荧光定量PCR法，检测试剂盒由苏州为真生物医药科技有限公司提供。检测EGFR基因第18、19、20、21外显子及K-ras基因第2号外显子的突变情况。按照使用说明书进行操作，Real-time PCR仪为Roche LightCyclerTM480。PCR反应共计4个阶段。第一阶段为酶激活阶段：95℃ 5min；第二阶段为PCR扩增阶段：95℃ 10s，60℃15s，72℃ 25s（荧光）共计50个循环；第三阶段为熔解过程：95℃ 1min，40℃1min，65℃ 1s，95℃ (检测荧光40次）；第四阶段为冷却过程：40℃ 10s。反应结束后，根据反应曲线判读反应结果。

1.4 统计学分析 应用SPSS19.0软件进行统计学分析。统计患者性别、年龄、吸烟史和组织学分型中EGFR和K-ras基因突变例数，及其它们所占的百分比。采用确切概率法对计数资料进行检验。检验水准α=0.05（双侧），以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR和K-ras基因突变检测情况 对154例非小细胞肺癌患者血清进行EGFR和K-ras基因突变检测，其中共有52例（33.8%）患者检测出EGFR基因突变，20例（13.0%）患者检测出K-ras基因突变，EGFR和K-ras共同发生突变的有4例（2.6%）。

附表1 EGFR中各基因突变情况统计

附表2 非小细胞肺癌患者EGFR和K-ras基因突变与相关的病理特征的关系

EGFR中各基因突变如附表1所示：EGFR18号外显子突变7例，突变检出率为4.5%、19号外显子突变15例，突变检出率为9.8%、20号外显子突变3例，突变检出率为1.9%、21号外显子突变21例，突变检出率为13.7%、19和21外显子共同发生突变为6例，检出率为3.9%。

2.2 EGFR和K-ras基因突变与病理特征的关系 EGFR基因突变检测中，如附表2所示：在154例检验的样本中，84例男性EGFR基因突变检出21例，比例为25%；70例女性EGFR基因突变检出31例，比例为44.3%，两者相比较具有统计学意义（P＜0.05）。67例吸烟患者检出突变10例，比例为14.9%；87例不吸烟患者中检出突变42例，比例为48.3%，两者相比较具有统计学意义（P＜0.05）。90例腺癌患者检出突变45例，比例为50.0%；64例非腺癌患者中检出突变7例，比例为10.9%，两者相比较具有统计学意义（P＜0.05）。比较EGFR基因突变与非小细胞肺癌各临床特征的关系，发现EGFR突变多发生在女性、不吸烟和腺癌的患者中，而EGFR与患者的年龄大小则不具有统计学意义（P>0.05）。而在K-ras基因突变检测中，K-ras与患者的年龄、性别、吸烟史和组织学分型等均不具有统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

近年来，肺癌已经成为威胁人类健康的主要恶性肿瘤。早期有报道表明，EGFR基因的突变主要发生在女性、不吸烟和腺癌的人群中。而且主要是以19和21外显子的突变最为常见[7]。本实验是对黑龙江地区的154例非小细胞肺癌样本进行检测，我们通过对EGFR基因突变的检测得到了与之前报道相似的结果。但是突变比例较其有不同。归其原因可能是由于黑龙江地区较其它地区地域性的差异所造成的。对于K-ras基因突变的检测，我们同样发现男性患者突变率略高于女性，并且腺癌患者明显高于非腺癌患者。由于我们病例有限，需要进一步扩大样本量以便得出统计学意义。

目前，靶向治疗以其高效、低毒、不良反应轻等优点跻身于抗肿瘤治疗的前列，但耐药现象是其应用受限的主要原因之一。在错综复杂的耐药机制中，EGFR和K-ras基因突变是导致靶向治疗TKI原发耐药[8]的重要机制之一。

研究表明，EGFR基因发生突变会导致肿瘤细胞的增殖、转移等[9]。K-ras基因是EGPR信号转导通路下游的一个基因，在EGFR的信号转导中有分子开关的作用，它的突变使得细胞不需要EGFR信号转导而直接激活下游的激酶系统，可直接导致肿瘤的发生[10]。国内外大量研究证实，肺癌患者EGFR基因突变状态与吉非替尼、盐酸厄洛替尼等靶向药物的疗效密切相关，EGFR基因突变的患者使用此类靶向药物治疗疗效显著，能够延长患者的生存期，而K-ras基因的突变可以使患者对吉非替尼产生耐药性。由于靶向治疗的药物价格昂贵，用药前有效地检测EGFR和K-ras的基因突变就显得尤为重要。

晚期NSCLC患者无法获得肿瘤组织时，可以使用外周血替代肿瘤组织进行突变检测。外周血循环DNA来自肿瘤细胞的坏死和脱落，相比正常人，肿瘤患者外周血循环DNA水平相对较高，其含量相当于正常人的10倍，且其特征可以良好的反应肿瘤遗传基因的特征。患者血液样本更易获取，创伤小，风险低，方便快捷，较易被患者接受，可重复取样进行EGFR基因检测，这可作为临床分子靶向治疗个体化预测的有效选择之一。

EGFR和K-ras信号通路的成功表明了部分NSCLC发生、发展的机制。然而目前大多数NSCLC信号通路仍不是很明确。因此寻求更加特异性的靶向分子和靶向药物，依旧是目前医学界不断探求的新方向。