大鼠肝纤维化和肝硬化MR-PWI参数与CD34和a-SMA的相关性

孟令平， 王国光， 胡明秀， 张洪， 官兵， 洪玉萍



·实验研究·

大鼠肝纤维化和肝硬化MR-PWI参数与CD34和a-SMA的相关性

孟令平， 王国光， 胡明秀， 张洪， 官兵， 洪玉萍

目的：探讨大鼠肝纤维化、肝硬化模型磁共振灌注成像(MR-PWI)参数的意义及其与CD34、a-SMA的相关性。方法：清洁级SD大鼠随机分为实验组(n=84)和对照组(n=16)。实验组采用硫代乙酰胺(TAA)腹腔定点注射，每次200 mg/kg，3次/周，对照组同期腹腔注射同剂量的生理盐水。建模第6～30周后实验租和对照组分批次行肝脏磁共振常规扫描及灌注成像。病理上将鼠肝损伤分为肝纤维化0期、Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期、肝硬化结节期，并与灌注参数TTP、WIR、WOR和免疫组化指标CD34、a-SMA表达作对照。结果：共有69只大鼠(实验组57只，对照组14只)成功获取MR-PWI参数，成功率69%(69/100)。实验组门静脉和肝实质的TTP随着肝纤维化及肝硬化进展而延长，而门静脉WIR、WOR在肝纤维化Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期下降不明显，肝硬化结节期则明显下降；肝实质WIR、WOR则随着肝纤维化、肝硬化进展而逐渐下降，各期之间差异有统计学差异(P<0.05)；各灌注参数与肝纤维化病理分期之间有较好相关性(P<0.05)。CD34和a-SMA表达在肝纤维化Ⅰ～Ⅱ期不明显，肝纤维化Ⅲ～Ⅳ期和肝硬化结节期则明显表达，与对照组比较，实验组肝纤维化Ⅲ～Ⅳ期和肝硬化期CD34、SMA表达均显著增加(P<0.01)。门静脉及肝实质灌注参数TTP、WIR、WOR和CD34、a-SMA表达有相关性(P<0.05)。结论：门静脉和肝实质TTP、WIR、WOR与大鼠肝纤维化、肝硬化不同分期之间有相关性，与CD34、a-SMA表达有相关性。

磁共振成像； 灌注加权成像； 肝纤维化； 肝硬化； 动物模型； 病理； 免疫组化

材料与方法

1.实验动物与分组

选用清洁级SD大鼠100只(上海睿太莫斯生物科技有限公司提供)，雄性，鼠龄6～7周，体质量180～200 g，在上海农林职业技术学院动物实验中心按标准方法饲养。大鼠随机分为两组：实验组(n=84)，硫代乙酰胺 (上海凌峰化学试剂有限公司)200 mg/kg，腹腔注射，3次/周，连续8周；第9周开始，增加20%，连续至第25周；第26周开始，再增加20%，连续至第30周。对照组(n=16)，正常喂饲，与实验组同样时间于腹腔内注射同量生理盐水。

2.磁共振检查

Philips Achive 1.5T超导型MR仪，小动物专用线圈。腹腔内注射10%水合氯醛(2 mg/kg)麻醉大鼠，棉纱布轻裹动物腹部后，头先进，俯卧置于线圈中央，试验组大鼠(6±1)～(30±1)周后批次(1～5只/次)、对照组同期(1～2只/次)行磁共振常规横轴面T1WI、抑脂T2WI检查。

灌注成像技术：抑脂THRIVE(3D T1-TFE)序列，TR 7.5 ms，TE 3.7 ms，翻转角10°，采集次数1，矩阵128×128，层厚2.0 mm，层间隔0 mm。全肝扫描层数10层，共55个时相，扫描时间120 s。由鼠尾静脉经留置针团注对比剂Gd-DTPA(0.5 mmol/mL；北陆药业)0.1 mL，随后续注0.5 mL生理盐水冲管，注射对比剂同时开始PWI扫描。原始灌注图像传入后处理工作站，采用“Basic T1 Perfusion”软件包，分别选择腹主动脉、门静脉和肝实质作为兴趣区(ROI)，自动绘制时间-信号强度曲线(time-signal intensity curve，TIC)。观察并记录：峰值时间(time to peak，TTP)，T0和峰值强度时间(T1)之间的时间；流入速率(wash in rate，WIR)，T0和峰值强度时间T1之间的最大斜率。流出速率(wash out rate，WOR)，峰值强度时间T1和测量末端之间的最大斜率。

3.病理学检查

所有大鼠均于全麻下切下肝组织，经10%甲醛固定后石蜡切片，行HE染色和Masson染色，2位病理医师镜下观察肝汇管区、肝窦壁及中央静脉等处胶原纤维增生情况。按文献[6]判断肝纤维化程度：0级为无成纤维细胞增生，胶原纤维量正常；Ⅰ级为汇管区扩大，少量成纤维细胞增生，胶原纤维轻度增生；Ⅱ级为汇管区内成纤维细胞增生，胶原纤维呈条状延伸；Ⅲ级为汇管区内成纤维细胞大量增生，胶原纤维形成小叶纤维隔；Ⅳ级为伴肝硬化假小叶形成。肝硬化结节期：大体观弥漫肝结节(直径≥2 mm)及镜下增生结节。

图5为Activiti引擎的系统服务结构图，给出了引擎提供的所有功能组件。ProcessEngineConfiguration是配置管理类，管理的对象包括ProcessEngine、XXservice和数据库session等。对于ProcessEngineConfiguration的配置，Activiti默认从activiti.cfg.xml中读取，也可从Spring的配置文件中读取。ProcessEngine提供有很多工作流方法的服务，都是线程安全的，下面对各服务的功能进行介绍。

4.免疫组化方法

SP法进行CD34、a-SMA免疫组化染色。镜下按每张切片阳性细胞比例及着色深浅计分，进行半定量分析。阳性细胞着色判定(A) ：低于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2 分，51%～75%为3分，高于75%为4分；阳性强度判定(B)：无着色或与背景均匀一致的呈淡黄色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据两项指标的积分数(积分= A×B)进行结果判定。结果由2名病理医师双盲判定，意见不一致时，由资深病理医师最终确定。

5.统计学处理

结　果

1．MR-PWI成功率及病理结果

建模过程中，55只实验组大鼠和14只对照组大鼠成功完成肝脏MR-PWI检查，成功率分别为65%(55/84)和87%(14/16)。55只实验组大鼠肝脏病理学分期：肝纤维化0期14只，肝纤维化Ⅰ～Ⅱ期19只，肝纤维化Ⅲ～Ⅳ期22只，肝硬化结节期14只。

2．MR-PWI表现

共69只大鼠获较满意肝灌注图像。注射对比剂后PWI图像上腔静脉、腹主动脉、门静脉显影，对照组肝实质灌注较均匀(图1)。肝纤维化期大鼠门静脉灌注曲线呈速升缓降型，峰值出现时间较主动脉晚，幅度较小；肝实质灌注曲线稳定，波动小，动脉期上升缓慢(图2)。肝硬化结节期门静脉灌注曲线上升较快并达峰值，下降慢略呈锯齿峰；肝实质灌注曲线上升缓慢；肝硬化结节曲线上升较快，曲线稳定(图3)。

3.门静脉灌注参数变化

注：经t检验，肝纤维化各期与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。

门静脉TTP随肝纤维化分期逐渐增加而增加，肝纤维化Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期、肝硬化结节期分别为(75.10±18.71)s、(83.79±23.24)s、(142.76±73.35)，与对照组(50.92±15.21)s相比，差异均有统计学意义(P<0.01，表1)。随着肝纤维化分期逐渐增加，门静脉灌注曲线最大上升斜率和最大下降斜率逐渐降低，对照组为(202.94±58.60)s和(51.64±18.10)/s；肝纤维化Ⅰ～Ⅱ期均值为(181.27±59.77)和(34.89±12.05)/s，肝纤维化Ⅲ～Ⅳ期为(162.96±91.15)和(43.52±26.32)/s，但差异无统计学意义(P>0.05)。而在肝硬化结节期，门静脉灌注曲线最大上升斜率和最大下降斜率为(41.10±35.68)和(10.84±7.33)/s，与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。

4.肝实质灌注参数变化

肝实质TTP随肝纤维化分期逐渐增加而增加，肝纤维化Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期、肝硬化结节期分别为(88.27±13.91)s、(82.82±23.81)s、(183.54±84.19)，与对照组(41.81±21.19)s相比，差异均有统计学意义(P<0.01，表2)。而WIR和WOR则随肝纤维化分期逐渐增加而递减，在肝硬化结节期递减最明显，对照组为(126.11±44.54)和(42.95±17.02)L/s；肝纤维化Ⅰ～Ⅱ期为(87.82±30.26)和(20.08±9.30) L/s，肝纤维化Ⅲ～Ⅳ期为(91.95±40.04)和(18.82±10.29) L/s，肝硬化结节期为(26.06±15.68)和(4.76±2.93)L/s，与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。

注：经t检验，肝纤维化各期与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。

5．MR-PWI灌注参数与肝纤维化病理分期的相关性

门静脉和肝实质TTP与肝纤维化分期呈正相关(r=0.686、0.681，P<0.01)，门静脉WIR、WOR和肝实质WIR、WOR与肝纤维化分期呈负相关(r=-0.506、-0.507、-0.551、-0.758，P<0.01)。

6.CD34和a-SMA在肝纤维化分期中的表达

CD34在正常大鼠肝窦小血管内皮细胞呈棕黄色阳性表达(图4)：随着肝纤维化程度加重，阳性表达范围逐渐扩大，呈多量棕褐色、窦壁连续阳性表达(图5)。肝硬化结节期， CD34也呈较明显阳性表达(图6)；a-SMA 在对照组仅表达于小血管(图7)；在肝纤维化期呈长梭形阳性表达(图8)，肝硬化结节期的a-SMA肝内表达明显(图9)。与对照组比较，肝纤维化组和肝硬化组的CD34、a-SMA之间的阳性表达差异见表3。

7.灌注参数与CD34、a-SMA表达的相关性

门静脉和肝实质TTP与CD34、a-SMA呈正相关(P<0.05，表4)；门静脉和肝实质WIR、WOR与CD34、a-SMA呈负相关(P<0.05，表4)。

讨　论

灌注加权成像(perfusion weighted imaging，PWI)能够观察肝脏微循环血流动力学变化，并对组织活性和功能进行评价[1-2]，本研究以TAA药物诱导大鼠肝纤维化、肝硬化模型为实验对象，采用对比剂团注示踪法进行检查，该方法能够反映组织血液灌注情况，从而间接评价组织微血管分布情况[3-5]；免疫组化指标CD34、a-SMA也能够反映组织微血管密度和窦性毛细血管化，因此，本研究结合对肝纤维化、肝硬化CD34、a-SMA的观察，从而探讨PWI参数及免疫组化指标对肝病损害程度的诊断效能。

表3　肝纤维化各期a-SMA、CD34表达与对照组比较

注：经t检验，肝纤维化各期与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。

表4　门静脉和肝实质灌注参数与CD34、a-SMA的相关性

正常肝组织主要为门静脉供血，肝脏TIC曲线呈缓升缓降的特点，随着肝纤维化、肝硬化发展，TIC曲线也逐渐出现速升缓降变化。灌注参数从不同角度反映了肝组织血流灌注情况，MTT代表对比剂通过组织所用时间，正常肝组织对比剂通过时间短，而肝纤维化、肝硬化期则使通过时间逐渐延长，其机理可能是肝纤维组织增生，假小叶形成造成肝血流异常，肝窦毛细血管化，不成对小动脉增多，窦后阻塞等，导致血管狭窄、闭塞，血流减慢，从而导致MTT时间延长；WIR代表由血管增强开始到增强峰值的斜率，WOR代表由血管增强峰值到第一循环结束时的斜率，两者都是单位时间内对比剂流入或流出引起组织信号升高或降低幅度和速度的改变，其变化程度受组织内对比剂浓度的高低、血管通透性及血流速度等多项因素影响[6-11]，因此，肝纤维化、肝硬化不同时期的斜率参数变化均低于正常肝组织。本实验显示TTP、WIR、WOR参数随着肝纤维化程度加重呈较为明显的相关性，其中，TTP为正相关，WIR、WOR为负相关，与文献报道一致[7，9]；但由于检查设备不同，灌注参数的表达也不尽相同，肝脏为双重血供，其灌注参数包括肝动脉和门静脉系统，肝动脉、门静脉灌注量以及肝的总灌注量等，其应用范围和定量分析不尽相同，对肝纤维化的诊断价值也不尽一致[12]。本实验受到检查设备软件限制，仅仅半定量分析了灌注参数TTP、WIR、WOR在不同时期肝纤维化、肝硬化中的数值变化，有其局限性，仍需进一步深入研究。

CD34、a-SMA均代表微血管密度和血管形成，文献认为肝纤维化、肝硬化发生、发展过程与血供改变和肝窦毛细血管化有较为明显的一致性[13-16]，本研究选择免疫组化指标CD34、a-SMA，便于观察肝纤维化、肝硬化时期的血供及血流变化情况，从而分析判断肝纤维化、肝硬化进展程度。肝纤维化主要病理改变是肝内细胞外间质(extracellular matrix，ECM)过度合成和异常沉积，从而导致肝纤维化，而肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是ECM 的主要来源，当HSC 被激活并转化为肌成纤维细胞即表达a-SMA，并合成大量ECM，因此HSC 活化增殖被认为是肝纤维化形成的中心环节，其中a-SMA是活化HSC的特异性标志物，其表达强度与肝纤维化分期呈正相关[16-17]，因此，将a-SMA表达可客观反映肝纤维化、肝硬化严重程度。肝纤维化早期，a-SMA表达主要发生在扩大的汇管区以及肝窦周隙细胞区域；随着肝纤维化程度加重，a-SMA表达也逐渐明显，肝硬化晚期出现新生及不成对的血管，形成较多闭塞血管及胆管纤维瘢痕，其纤维隔内的a-SMA表达呈强阳性，动物实验表明，随着造模时间延长，a-SMA表达与肝纤维化、肝硬化严重程度呈正相关，与文献报道一致[16]。正常肝脏血窦不表达血管相关抗原，但随着肝纤维化及肝硬化甚至癌变，各种血管相关性抗原表达逐渐明显，一般认为这种变化与肝窦毛细血管化有关。本研究结果也证实随着肝损伤的进展，肝窦中各种血管相关性抗原表达逐渐明显，CD34在肝纤维化、肝硬化血窦中表达逐渐增加，其阳性表达与微血管密度范围有关，正常肝实质为阴性或仅呈弱阳性，随着肝纤维化、肝硬化进展，肝窦CD34阳性表达明显增加，肝硬化结节晚期表现为弥漫分布的强阳性表达，反映了CD34的阳性表达与肝纤维化、肝硬化严重程度的相关性，本实验结果与文献报道一致[18-19]。

门静脉与肝实质灌注参数以及免疫组化指标均能够反映肝纤维化、肝硬化发展的严重程度，二者在肝纤维化、肝硬化分期判断方面有一定的相关性，本组实验得出灌注参数与CD34、a-SMA之间也有一定相关性。因此，两种不同检测指标均能反映肝纤维化、肝硬化的发展严重程度，为临床判断病情提供了较为可靠的依据。本研究存在不足之处：两种指标均为半定量数据，有一定的主观偏差，并且，受测量方法及设备参数限制，其远期判断效果仍有待于进一步验证。

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The correlation of magnetic resonance perfusion parameters and CD34、 a-SMA of liver fibrosis and cirrhosis in rats

MENG Ling-ping,WANG Guo-guang,HU Ming-xiu,et al.

Department of Radiology,Jinshan Branch,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai 201599,China

Objective:To study the value of magnetic resonance perfusion-weighted imaging (PWI) parameters in rat models with liver fibrosis and cirrhosis,as well as their correlation with CD34,a-SMA expression.Methods:One hundred clear Sprague-Dawley (SD) male rats were randomly divided into experimental group (n=84) and control group (n=16).Thioacetamide (TAA) intraperitoneal injection,200mg/kg,3 times per week were performed in experimental group;while,0.9% sodium chloride solution of the same volume was injected into the abdominal cavity in control group.The rats both in experimental and control groups underwent conventional MRI and PWI on the 6～30th weekend after the modeling.Liver damage was divided into liver fibrosis stage 0,stage Ⅰ～Ⅱ,stage Ⅲ～Ⅳ,nodular cirrhosis pathologically.Correlation of time to peak (TTP),wash-in rate (WIR),wash-out rate (WOR) and CD34、 a-SMA expression in different stages of liver lesion were analyzed.Results:Totally sixty-nine rats including experimental group (n=57) and control group (n=14) had MR perfusion study performed successfully，with the success rate as 69% (69/100).In experimental group,TTP of portal vein and liver parenchyma prolonged along with the progress of liver fibrosis and cirrhosis，while WIR，WOR of portal vein were not decreased obviously in liver fibrosis stage Ⅰ～Ⅱ and Ⅲ～ Ⅳ,however,which decreased significantly in cirrhosis.The WIR,WOR of liver parenchyma declined gradually with the progress of liver fibrosis and cirrhosis,with significant statistic difference in different stages (P<0.05).The perfusion parameters showed correlation with the pathologic stages of liver fibrosis (P<0.05).CD34 and a-SMA expression were not obvious in liver fibrosis stage Ⅰ～Ⅱ,while which were significantly expressed in liver fibrosis stage Ⅲ～ Ⅳ and cirrhosis.Compared with the control group,CD34,SMA expression of experimental group stage Ⅲ～Ⅳ and cirrhosis increased significantly,with statistic difference (P<0.05).TTP,WIR,WOR and CD34,a - SMA expression in portal vein and liver parenchyma had significant correlation (P< 0.01).Conclusion:The TTP,WIR,WOR of portal vein and hepatic parenchymal showed good correlation in different stages of liver fibrosis and cirrhosis in rats as well as showing,correlation with CD34,a-SMA expression.

Magnetic resonance imaging； Perfusion weighted imaging； Liver fibrosis； Liver cirrhosis； Animal models； Pathology； Immunohistochemical

201599上海，上海市第六人民医院金山分院放射科(孟令平、王国光、胡明秀、张洪)，病理科(官兵、洪玉萍)

孟令平(1963-)，男，湖北十堰人，硕士，主任医师，主要从事腹部影像诊断和介入治疗工作。

上海市科委医学引导类项目基金(12119b1400)

R445.2； R575.2

A

1000-0313(2016)07-0580-06

10.13609/j.cnki.1000-0313.2016.07.002

2015-12-28)