顺磁性抗HER2免疫脂质体的制备及MR靶向成像研究

陈维翠， 刘淑仪， 林爱华， 刘波， 刘岘



·实验研究·

顺磁性抗HER2免疫脂质体的制备及MR靶向成像研究

陈维翠， 刘淑仪， 林爱华， 刘波， 刘岘

目的：制备顺磁性抗HER2免疫脂质体，探讨其对荷人乳腺癌裸鼠模型的MR特异成像作用。方法：制备顺磁性抗HER2免疫脂质体，评价其理化特性及体外细胞结合特性。动物试验选择12只荷人乳腺癌裸鼠，分为2组进行磁共振扫描。实验组为顺磁性抗HER2免疫脂质体组，对照组为钆布醇组。测量平扫及静脉注射对比剂后第10分钟、1小时、6小时后，肿瘤组织在T1WI的信号强度，计算并比较不同实验组内肿瘤组织的强化率和对比度噪声比。结果：顺磁性抗HER2免疫脂质体的平均粒径为134.2 nm，多分散系数为0.29，Zeta电位为-32.49 mV，r1弛豫率为4.67/mM·s；与HER2高表达的SK-BR-3乳腺癌细胞表现为特异性结合，胞浆出现罗丹明红染。注射顺磁性抗HER2免疫脂质体后，肿瘤组织表现为显著持久的强化；增强10 min后肿瘤强化率为121%，1 h后肿瘤强化率为185%，6 h后肿瘤强化率为224%。对照组在静脉注射钆布醇10 min后，肿瘤组织表现为显著强化，强化率为153%，1 h后的信号强度与平扫相近。两组实验动物在注射对比剂后第1、6 h后，肿瘤组织的强化率、CNR差异具有统计学意义。结论：顺磁性抗HER2免疫脂质体具有长循环时间，高r1弛豫率，对乳腺癌具有特异性靶向作用。

顺磁性； 免疫脂质体； 磁共振成像； 对比剂

免疫脂质体作为新型药物运输载体，具有降低药物毒性、改善药物稳定性和组织学分布等优点，在抗肿瘤药物的靶向治疗、基因、疫苗制备等方面显示出巨大的优势[1-2]。免疫脂质体也可作为对比剂的运输载体[3]，通过对荧光材料、顺磁性、超顺磁性物质进行封装，实现对生物组织的特异靶向显像。本文尝试制备装载顺磁性Gd对比剂的抗HER2免疫脂质体，以实现对HER2高表达乳腺癌靶向MR成像的目的。

材料与方法

1．实验材料

1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(poly(ethylene glycol))-2000，PEG2000-DSPE]、罗丹明-磷脂酰乙醇胺(rhodamine-PE)、马来酰胺-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 [ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(poly(ethylene glycol))2000，Mal-PEG2000-DSPE]，购自美国Avanti Polar Lipids 公司；Gd-DTPA-硬脂酰胺 [Gd-DTPA-bis(stearylamide), Gd-BSA]购自美国Gateway Chemical Technology公司；N-琥珀酸亚胺S-硫代乙酸盐(酯)(N-Succinimidyl S- acetylthioacetate, SATA)、胆固醇(cholesterol，Chol)购自美国Sigma公司。

人源性重组抗HER2单克隆抗体购自Genentech Inc.(South San Francisco，CA)。抗HER2单抗片段按照Carter文献报道方法制备[4]。人乳腺癌细胞株SK-BR-3、MCF-7购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，肿瘤细胞扩增按照标准程序完成。

2．顺磁性长循环脂质体的制备

顺磁性长循环脂质体的制备采用薄膜水合法，将Gd-BSA,DSPC,chol和PEG2000-DSPE按照0.75：1.10：1：0.15的摩尔比例，溶于氯仿/乙醚混合液(体积比1:1)，脂质总量为120 μmol，在40℃条件下旋转蒸干形成薄膜。此外，加入0.001 mol/L的rhodamine-PE用于荧光成像。

3．顺磁性抗HER2单克隆抗体免疫脂质体的制备

采用巯基-顺丁烯二酰亚胺偶联法(sulfhydryl-maleimide coupling method)，将抗HER2单抗片段结合至Mal- PEG2000- DSPE链的远端。具体步骤为首先使用SATA对抗HER2单抗片段(1 mg/mL)进行修饰(抗体与SATA的摩尔比为8:1)，室温下孵育45 min，HBS缓冲液洗脱4次后，采用旋转离心方法(50kD分子量截留)去除游离的SATA。SATA衍生的抗体片段与羟胺溶液在室温下混合孵育1 h以去乙酰化。形成的活性抗体加入含有Mal-PEG2000-DSPE的顺磁性长循环脂质体(蛋白/脂质比例为50 μg/μmol)，高速离心去除未结合的抗体(65000 rpm，45 min)，移去上清液后，脂质体悬液在氮气4℃条件下储存备用。

4．顺磁性脂质体理化特性测定

①粒径及Zeta电位测定：取纯化脂质体混悬液适量，加适量双蒸水稀释后，采用Malvern 3000HS激光粒度分析仪测定其粒径及zeta电位。

②r1弛豫率测定：顺磁性抗HER2免疫脂质体使用生理盐水稀释为不同浓度，Gd浓度采用电感耦合等离子体原子发射光谱测定(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES) (Optima 3000 DV,Perkin Elmer,MA,USA)。r1弛豫率测量采用400 mHz MR光谱仪(DRX-400 9.4T,Bruker，中科院广州化学研究所)，反转恢复脉冲序列(inversion recovery，IR)，35 mm射频发射接收线圈，成像参数为TE 30 ms，TR分别选择15,30,60,100,150,200,300,450,600,900,1500,3000,6000及12000 ms，视野40 mm×40 mm，矩阵128×128，在40℃测定顺磁性对比剂的体外T1弛豫时间，计算r1弛豫率。r1弛豫率定义为T1弛豫速率(1/T1)与Gd浓度比值斜率。

5．细胞结合实验

选择人乳腺癌细胞SK-BR-3(HER2高表达)、MCF-7(HER2低表达)与罗丹明标记的免疫脂质体在37℃下孵育2 h，采用共聚焦荧光显微镜观察细胞悬液。罗丹明-PE的激励、发射波长分别选择560 nm、590 nm。

6．MR动物实验

①荷瘤裸鼠模型的制作：选择HER2高表达SK-BR-3人乳腺癌细胞进行培养，当活细胞比率>90%，细胞浓度为2×106/mL时，按0.2 mL/只裸鼠注射于实验动物右侧肩背部皮下。肿瘤生长8～10周，直径约1 cm时，进行MR扫描。

②MR扫描方案及数据分析：12只荷人乳腺癌裸鼠，分为两组，其中顺磁性抗 HER2免疫脂质体组6只，钆布醇对照组6只。实验动物经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，固定后进行MR扫描。对比剂静脉注射剂量为0.05 μmol/g体重。

MR扫描选择GE Signal HDX 3.0T超导型MR扫描仪，50 mm自制鸟笼线圈bird cage coil。扫描参数为横轴面自旋回波T1WI，TR 500 ms，TE 14 ms，视野40 mm×40 mm,，层厚2 mm，矩阵256×256。测量平扫及增强扫描后10 min、1 h、6 h的肿瘤、肌肉组织的信号强度、背景噪声信号强度及标准差，计算肿瘤组织的强化率、对比度噪声比(contrast-to-noise ratio，CNR)。

7．病理学检查

MR扫描结束后，处死实验动物，肿瘤组织固定后行常规HE染色和免疫组织化学检查。

注：两样本t检验，注射顺磁性抗HER2免疫脂质体、钆布醇后的1h和6h，两组乳腺癌肿瘤组织的强化率、CNR差异有统计学意义(P<0.01)。

结　果

1．顺磁性抗HER2免疫脂质体的理化特性

顺磁性抗HER2免疫脂质体的平均粒径为134.2 nm，电位为-32.49 mV，多分散系数为0.29(图1)，r1弛豫率为4.67/mM·s。

2．体外细胞结合实验

激光共聚焦荧光显微镜显示免疫脂质体在细胞内的分布情况：HER2高表达SK-BR-3乳腺癌细胞内，罗丹明标记抗HER2免疫脂质体发生内化，胞浆出现罗丹明红染；而在HER2低表达MCF-7乳腺癌细胞内，由于免疫脂质体不发生特异性结合，故无明显染色(图2)。

3．肿瘤组织MR强化表现

注射顺磁性抗HER2免疫脂质体后，乳腺癌组织表现为显著持久的强化；注射10 min后，肿瘤组织即表现为不均匀显著强化，平均强化率为121%，在随后的1 h及6 h后，肿瘤仍保持较高的信号强度，1 h肿瘤强化率为185%，6 h后肿瘤强化率为224%，此时心腔内仍可见高信号对比剂存在。对照组在静脉注射钆布醇10 min后，肿瘤组织表现为不均匀显著强化，强化率约为153%；随即各个时间点内肿瘤组织信号强度下降，1 h后的信号强度与平扫相近(图3)。注射对比剂第1、6 h后，两实验组肿瘤组织的强化率和CNR差异有着统计学意义(P<0.01，表1)。

4．病理学检查结果

HE染色显示SK-BR-3乳腺癌细胞呈不规则团状排列，部分癌团可见坏死灶，伴有脂肪细胞、淋巴细胞浸润，局部癌细胞间质纤维组织增生；免疫组化染色显示SK-BR-3乳腺癌细胞膜呈HER2强染色(图4)。

讨　论

免疫脂质体由脂质体与单克隆抗体或基因抗体连接而成。通过抗体与靶细胞表面的抗原/受体特异性结合，经吞噬、吞饮等多种方式，免疫脂质体可释放出包封的药物或对比剂，实现靶向治疗或特异性显像的目的[5-6]。

图3不同实验组内乳腺癌肿瘤组织的平扫及强化图像。a) 顺磁性抗HER2免疫脂质体组平扫T1WI图像； b) 增强扫描后10min T1WI图像； c) 增强扫描后1h的T1WI图像； d) 增强扫描6h的T1WI图像； e) 钆布醇组平扫T1WI图像； f) 增强扫描后10min的T1WI图像； g) 增强扫描1h的T1WI图像； h) 增强扫描6h的T1WI图像。

理想的免疫脂质体应具有简单快速稳定的连接方式、能在血液循环中保持长时间的空间稳定性和良好的抗原识别能力。本次实验采用SATA耦联剂制备顺磁性免疫脂质体，将抗HER2单克隆抗体片段Fab'活化修饰后，连接于PEG链末端。PEG在脂质体表面形成亲水性空间立体屏障，阻止血清内调理素与脂质体结合，延长脂质体的循环时间[7-8]。本实验中，单抗片段修饰所使用的SATA为新型硫化剂，其活性NHS酰基端与抗体氨基基团反应后，可形成稳定的酰胺键。抗体的巯基基团被修饰保护后，不会发生降解；且脱保护作用在中性PH环境中即可进行，无需加入还原剂[9]。修饰后的抗体与PEG远端通过共价键结合，与其它抗体-脂质体交联方式(如二硫键、氨键或Schiff's碱)相比，这种连接方式保持了抗体的二价结构，可避免抗原结合的空间阻碍效应，保证了抗原结合位点不受影响，且耦联效率高，脂质体也能结合较多数量的抗体[9]。

弛豫率是考察顺磁性免疫脂质体系统的另一重要指标。本实验采用的顺磁性标记物Gd-DTPA-硬脂酰胺，为两性Gd螯合物，可结合到脂质体的磷脂双分子层内。与将顺磁性螯合物包裹于脂质体内层水相的制备方法相比，克服了水分子跨膜运动受限的缺点[10]。脂质体内外层的水分子交换，可直接使自由水与脂质双分子层内的Gd螯合物发生磁化反应，延长旋转相关时间(rotation correlation time,τR)，增加r1弛豫率[11-12]。体外弛豫率结果表明，这一顺磁性脂质体系统具有较高的r1弛豫率。

动物实验结果表明，静脉注射顺磁性抗HER2免疫脂质体后，肿瘤组织产生了显著持久的强化，强化时间长达6 h。除顺磁性抗HER2免疫脂质体具有较高的r1弛豫率外，这主要是通过被动靶向(增强渗透滞留效应，EPR)和主动靶向(抗体介导)两种机制实现的。前者是由于肿瘤新生血管和缺陷的淋巴引流/清除能力，导致PEG长循环脂质体能在肿瘤间质内停留较长时间(一般>6 h)[13-14]。后者是通过免疫脂质体的抗体-抗原特异性结合反应实现的，抗HER2免疫脂质体经Fab'片段，选择性与HER2高表达乳腺癌肿瘤细胞结合，并经受体介导的内吞作用发生内化。细胞结合荧光电镜结果表明，抗HER2免疫脂质体经受体介导的内吞噬作用后，荧光染色主要位于SK-BR-3乳腺癌细胞浆内和细胞核周围。而对照组HER2低表达MCF-7乳腺癌细胞则无明显累积。除此以外，抗体的Fab'片段无FC部分，免疫源性低，可减少单核吞噬细胞系统的摄取，表现为半衰期延长，更易被动转运通过渗漏的肿瘤血管内皮层，从而进一步提高靶向成像效果[15-16]。

综上，本次实验所制备的顺磁性抗HER2免疫脂质体具有长循环时间，高r1弛豫率和特异性靶向作用。抗体与脂质体为共价结合方式，形成的免疫脂质体更加有效。所使用的Fab'抗体片段具有较低的免疫源性。这一系统可作为MR对比剂的靶向载体，进一步加载抗肿瘤药物，实现对抗肿瘤药物的疗效的实时监测。值得指出的是，由于顺磁性脂质体的制备及成像效果受多种因素影响，如脂质材料、粒径大小、表面电荷等脂质体理化特性及装载顺磁性螯合物的链长度等[17]，需要在进一步的研究中加以注意。

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Preparation of paramagnetic anti-HER2 immunoliposome and MR targeted imaging

CHEN Wei-cui,LIU Shu-yi,LIN Ai-hua,et al.

Radiology of Department,the second Affiliated Hospital,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510120,China

Objective:To prepare paramagnetic anti-HER2 immunoliposome,and to study its specific character in MR imaging using nude mice bearing human breast cancer model.Methods:Paramagnetic anti-HER2 immunoliposome was prepared,its physic-chemical characteristics as well as intracellular distribution were evaluated.Twelve nude mice bearing SK-BR-3 tumor were chosen as experiment animal,which were divided into two groups.Plain and contrast enhanced MR imaging were performed.Paramagnetic anti-HER2 immunoliposome was used as contrast agent for the experimental group and Gadobutrol was used for the control group.The signal intensities on T1WI in plain MRI and at 10min,1h,and 6h after contrast injection were measured respectively.The enhanced rate and contrast-to-noise ratio (CNR) of tumor in the two groups were calculated and compared.Results:The mean diameter,polydisperisity index,zeta potential and r1relexivity of paramagnetic anti HER2 immunoliposome were 134.2nm,0.29,-32.49mV and 4.67/mM·s respectively,showing specific binding with high-expressed SK-BR-3 breast cancer cells,rhodamine fluorescence was detected intensively in cytoplasm.After paramagnetic anti-HER2 immunoliposome was injected,marked and long-lasted enhancement in tumor tissue could be assessed,the enhanced rate was 121% after 10min,185% after 1h and 224% after 2h of enhancement.However,in the contrast group,after Gadobutrol as contrast agent was injected,tumor tissue enhanced obviously after 10min,the enhanced rate was 185%,yet the signal intensity decreased 1h after,which was closed to that as plain MRI.The enhanced rate,CNR of tumor 1h and 6h after injection of contrast agent in these two groups showed significant statistic difference.Conclusion:Paramagnetic anti-HER2 immunoliposomes show long circulation time,high r1relaxivity,could be served as a specific target agent for breast cancer.

Paramagnetic; Immunoliposomes; Magnetic resonance imaging; Contrast agent

510120广州，广州中医药大学第二附属医院影像科(陈维翠、刘淑仪、刘波、刘岘)，药学部(林爱华)

陈维翠(1986-)，女，广西贺州人，硕士，住院医师，主要从事影像诊断工作及分子影像学研究。

刘岘，E-mail：liuxian74@hotmail.com

国家自然科学基金(30700184)；广东省科技计划项目 (2013B021800247)

R445.2 ；

A

1000-0313(2016)07-0586-05

10.13609/j.cnki.1000-0313.2016.07.003

2015-12-28)