乳铁蛋白对口腔癌细胞中VEGF和bFGF表达的影响

霍　安

(江苏省丹阳市人民医院，江苏 丹阳　212300)



乳铁蛋白对口腔癌细胞中VEGF和bFGF表达的影响

霍安

(江苏省丹阳市人民医院，江苏 丹阳212300)

目的探讨乳铁蛋白对口腔癌细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响.方法选用人口腔鳞癌细胞系CAL-27，分为0.006，0.013，0.025，0.050 g/L重组人乳铁蛋白实验组和空白对照组.应用RT-PCR法检测VEGF和bFGF mRNA表达水平；应用Western Blot法检测VEGF和bFGF蛋白表达水平.结果CAL-27口腔癌细胞VEGF和bFGF mRNA均随着乳铁蛋白浓度增加表达量逐渐减少；0.050 g/L乳铁蛋白实验组VEGF 和bFGF mRNA表达量明显低于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05).CAL-27口腔癌细胞VEGF和bFGF蛋白产物随着乳铁蛋白浓度增加表达量逐渐减少；0.050 g/L乳铁蛋白实验组VEGF，bFGF蛋白表达量明显低于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05).结论乳铁蛋白可有效抑制口腔癌细胞系CAL-27细胞中VEGF，bFGF的转录和表达，进而抑制血管生成，可作为乳铁蛋白抗口腔癌的机制之一.

口腔癌；乳铁蛋白；血管内皮生长因子

【引用格式】霍安.乳铁蛋白对口腔癌细胞中VEGF和bFGF表达的影响[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(5)：636-639.

乳铁蛋白是存在于母乳中的一种铁结合糖蛋白，其不仅参与铁的转运，还具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能.血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是刺激肿瘤血管生成的主要细胞因子.口腔癌是头颈部的多发恶性肿瘤，居恶性肿瘤的第5位，临床治疗过程中往往会引发患者进食障碍、言语不清等部分脏器功能丧失[1]，因此探寻新的低毒、高靶向性治疗药物具有重要意义.本次研究从分子生物学角度探讨了乳铁蛋白对人口腔鳞癌细胞系CAL-27细胞VEGF，bFGF表达的影响，分析其可能的调控作用，旨在探寻口腔癌天然靶向治疗新途径.

1　材料与方法

1.1材料

人口腔鳞癌细胞系CAL-27(上海素尔生物科技有限公司) ；重组人乳铁蛋白(武汉禾元生物科技股份有限公司)溶于PBS中，质量浓度为5 g/L，-20 ℃储存备用.RT-PCR主要试剂：Ribozol RNA抽提试剂、AMV反转录酶(上海拜力生物科技有限公司)，并由该公司合成VEGF、bFGF、β-肌动蛋白的上下游引物.Western Blot主要试剂：VEGF抗体，bFGF、β-肌动蛋白抗体(上海瑞齐生物技术有限公司)；兔抗人IgG-HRP酶(武汉博士德生物工程有限公司).

1.2RT-PCR检测

重组人乳铁蛋白在体外可抑制人口腔鳞癌细胞系CAL-27的增殖，表现为剂量依赖性生长抑制，与具体作用时间无明显相关[2].本次研究采用重组人乳铁蛋白作用24 h后的细胞为实验材料，细胞消化后计数，2×105个/孔接种到24孔板，将其分为5组：0.006，0.013，0.025，0.050 g/L重组人乳铁蛋白实验组，空白对照组，孵育24 h后提取细胞总RNA.取4 μg RNA反转录合成cDNA，并将其作为模板，β-肌动蛋白为内参，常规条件下进行PCR反应，共30个循环，72 ℃下延伸10 min.琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，凝胶成像系统测定电泳条带的OD值，计算PCR产物的相对量.

1.3Western Blot检测

胰蛋白酶消化细胞后计数，按1×106个/孔接种到6孔板上.细胞分组同1.2，孵育24 h后细胞裂解，提取蛋白并用双金鸡纳酸法测定浓度.细胞蛋白提取物定量后行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，再加入相应的一抗(1∶500)，室温孵育3 h，加入二抗，电化学发光检测、显影、定影.扫描胶片，凝胶成像系统测定目标条带的吸光度值.

1.4统计学分析

2　结　　果

2.1乳铁蛋白对口腔癌细胞VEGF和bFGF mRNA表达影响

CAL-27口腔癌细胞VEGF，bFGF基因的PCR产物经乳铁蛋白刺激24 h后，表达量随着乳铁蛋白浓度增加而逐渐减少；0.050 g/L乳铁蛋白实验组VEGF mRNA，bFGF mRNA表达量均明显低于空白对照组，差异具有统计学意义(t=8.441，7.175，P<0.05).见表1.各组细胞PCR产物SDS-PAGE凝胶电泳见图1.

表1　不同组口腔癌细胞VEGF和bFGF mRNA表达情况比较

注：与空白对照组相比，*：P<0.05

2.2乳铁蛋白对口腔癌细胞VEGF和bFGF 蛋白表达影响

CAL-27口腔癌细胞VEGF，bFGF蛋白产物经乳铁蛋白刺激24 h后，表达量随着乳铁蛋白浓度增加而逐渐减少；0.050 g/L乳铁蛋白实验组VEGF，bFGF蛋白表达量均明显低于空白对照组，差异具有统计学意义(t=5.405，6.281，P<0.05).见表2.各组细胞β-肌动蛋白、VEGF、bFGF蛋白的Western Blot检测结果见图2.

注：与空白对照组相比，*：P<0.05

3　讨　　论

乳铁蛋白作为恶性肿瘤化学预防和治疗药物成为目前肿瘤治疗领域的研究热点.相关研究显示：乳铁蛋白在有效抑制头颈部鳞状细胞癌增生的同时对口腔黏膜正常上皮细胞分化无明显影响.目前，关于乳铁蛋白抑制癌细胞增殖、分化的分子机制尚未明确.

血管生成因子在实体肿瘤发生、发展和转移中起到关键作用，在此过程中部分细胞因子起着调控血管生成的作用.众多血管生成因子中，VEGF，bFGF是最有力的可溶性促血管生成因子.相关研究显示：VEGF，bFGF在口腔鳞状细胞癌组织中存在高表达，在口腔癌的发生、发展中发挥重要作用[3].国外研究者最新研究显示：牛乳铁蛋白肽在哺乳动物体内及体外均具有抗血管生成活性[4].Amuthachelvi等[5]研究显示：在内皮细胞表面乳铁蛋白肽能够与VEGF，bFGF竞争肝素样结合位点，进而降低上皮细胞增殖、转移的发生率，减少血管生成的发生.Chang H-Y等[6]研究显示：乳铁蛋白能够有效抑制内皮细胞功能，激活抗血管生成因子IL-18的活性，最终抑制血管生成.本次研究针对乳铁蛋白抗口腔癌细胞生长活性进行研究，选取口腔癌细胞生长敏感指标VEGF，bFGF作为研究对象，结果显示：随着乳铁蛋白质量浓度的增加，VEGF，b FGF 的mRNA及蛋白的表达呈下降趋势，0.050 g/L乳铁蛋白刺激24 h后VEGF，b FGF的mRNA及蛋白的表达水平明显降低，说明乳铁蛋白能够直接作用于口腔癌细胞的血管生长因子VEGF，b FGF，降低其表达水平，进而抑制血管生成，起到抑制口腔癌细胞增长、转移的目的.

临床肿瘤治疗中，血管生成抑制剂是目前关注的热点，有多种相关新药上市并逐渐推广应用，但多数为化学合成药物[7].本次研究发现：乳铁蛋白可有效抑制口腔癌细胞CAL-27中VEGF，bFGF基因的转录和表达，进而抑制口腔癌病情进展.针对血管生成这个治疗癌症的靶点，乳铁蛋白能够成为口腔癌预防和辅助治疗的天然候选药物.

[1] 韩晟，陈衍，谢诚，等.576例口腔癌患者的流行病危险因素研究[J].实用口腔医学杂志，2012，28(1)：74-78.

[2] Colley H E，Eves P C，Pinnock A，etal.Tissue-engineered oral mucosa to study radiotherapy-induced oral mucositis[J].International Journal of Radiation Biology，2013，89(11)：907-914.

[3] J M Seoane，A González-Mosquera，J Velo-Noya，etal.La biopsia oral en el contexto del precáncer y del cáncer oral biopsy in the context of oral cancer and precancer[J].Avances en Odontoestomatología，2013，24(1)：102-107.[4] Yoshiyuki Uchiyama，Takahiro Hayasaka，Noritaka Mas- aki，etal.Imaging mass spectrometry distinguished the cancer and stromal regions of oral squamous cell carc- inoma by visualizing phosphatidylcholine (16：0/16：1) and phosphatidylcholine (18：1/20：4)[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2014，406(5)：1307-1316.

[5] Amuthachelvi Daniel，Aruna Prakasarao，Balu David，etal.Raman mapping of oral tissues for cancer diagnosis[J].Journal of Raman Spectroscop，2014，45(7)：541-549.[6] Chang H Y，Hor S Y，Lim K P，etal.Oral cancer secretome：Identification of cancer-associated proteins[J].Electrophoresis：The Official Journal of the International Electrophoresis Society，2013，34(15)：2199-2208.[7] Arias L R，Lane T S.Real-time electrical impedanceb- ased measurement to distinguish oral cancer cells and non-cancer oral epithelial cells[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2011，399(5)：1823-1833.

【责任编辑：陈丽华】

2014年中国科技核心期刊综合大学学报类核心影响因子排序*

*源于中国科学技术信息研究所《2015年版中国科技期刊引证报告(核心版)》，2015：130-131.

Effect of Lactoferrin on the Expression of VEGF and bFGF in Oral Cancer Cells

Huo An

(Danyang People’s Hospital of Jiangsu Province，Danyang 212300，China)

Objective To investigate the effect of lactoferrin on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) in oral cancer cells.Method Human oral squamous cell carcinoma cell line CAL-27 was divided into 0.006，0.013，0.025 and 0.050 g/L recombinant human lactoferrin groups and blank control group.The expression of VEGF and bFGF mRNA s was detected by RT-PCR，and the expression level of VEGF and bFGF proteins was detected by Western Blot.Results Both VEGF and bFGF mRNA expressions in CAL-27 oral cancer cells decreased gradually with the increase in lactoferrin concentrations；in 0.050 g/L lactoferrin group，expressions of VEGF and bFGF mRNA were significantly lower than those in the blank control group (P<0.05).VEGF and bFGF protein products expressions in CAL-27 oral cancer cells decreased gradually with the increase in lactoferrin concentrations；in 0.050 g/L lactoferrin group，protein expressions of VEGF and bFGF were significantly lower than those in the blank control group (P<0.05).Conclusion Lactoferrin can effectively inhibit the transcription and expression of VEGF and bFGF in oral cancer cell line CAL-27 cells，thereby inhibiting the angiogenesis，which can be one of mechanisms though which lactoferrin exert its anti-oral cancer.

oral cancer；lactoferrin；vascular endothelial growth factor

1009-4822(2016)05-0636-04

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.05.017

2016-03-02

江苏省卫生厅科技发展计划项目(H2014-30).

霍安(1977-)，男，副主任医师，主要从事口腔学临床研究，E-mail：983808405@qq.com.

R739.8

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