rHEPO对大鼠急性视网膜光损伤的保护作用及时效性研究

黄靖妍，杨　曦

(1.北华大学附属医院，吉林 吉林　132011；2.吉林市龙潭区妇幼保健院，吉林 吉林　132021)



rHEPO对大鼠急性视网膜光损伤的保护作用及时效性研究

黄靖妍1，杨曦2

(1.北华大学附属医院，吉林 吉林132011；2.吉林市龙潭区妇幼保健院，吉林 吉林132021)

目的探讨重组人促红细胞生成素(rHEPO)对大鼠急性视网膜光损伤的保护作用及时效性.方法选取4周龄雄性SD大鼠48只，随机分成5组：正常对照组、模型对照组、模型治疗1、2、3组，其中正常对照组8只，其余各组均为10只，应用手术显微镜(光照强度为(22 000±1 000) lux)对模型各组造模.模型治疗1、2、3组：分别在光照前4 h、光照后立即、光照后3 d按照5 000 IU/kg腹腔注射rHEPO 1次.模型对照组：光照前后均未给予药物干预.7 d后处死所有大鼠，摘取眼球，应用苏木精-伊红(HE)染色观察视网膜的变化；应用免疫组织化学的方法检测Caspase-3的表达.结果1)HE染色：正常对照组中大鼠视网膜各层结构完整，层次分明，排列整齐，细胞核形态规整，染色均匀.模型对照组中大鼠视网膜光感受器内、外节排列紊乱，有空泡形成，部分断裂；外核层较正常对照组明显变薄(P<0.05)，核间隙加大，部分有碎核现象.模型治疗各组大鼠视网膜光感受器内、外节排列紊乱，有小空泡形成；外核层较正常对照组有不同程度变薄(P<0.05)，模型治疗1、2组好于模型对照组(P<0.05)，且1组优于2组(P<0.05)，模型治疗3组与模型对照组比较差异无统计学意义.2)Caspase-3表达：与正常对照组相比，模型各组的Caspase-3表达均有所增强(P<0.05)；模型治疗1、2、3组表达依次增强，两两比较差异具有统计学意义；模型对照组与模型治疗3组表达最强，二者之间无差异(P>0.05).结论rHEPO对视网膜光损伤具有保护作用，并具有一定的时效性，早期用药效果好，其中光损伤前4 h预用药优于光损伤后立即用药.

重组人促红细胞生成素；视网膜光损伤；Caspase-3；细胞凋亡

【引用格式】黄靖妍，杨曦.rHEPO对大鼠急性视网膜光损伤的保护作用及时效性研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(5)：628-631.

随着科技的发展、环境的改变，各种光污染导致的视网膜光损伤问题逐步引起人们的重视.迄今为止，视网膜光损伤的机制还不十分清楚，多年来的研究发现其病理特征主要为视网膜光感受器细胞的凋亡[1].促红细胞生成素(EPO)是具有多种能力的生长因子，具有抗凋亡[2]、抗氧化[3]等作用.Grimm等[4]还发现：对于光损伤导致的视网膜感光细胞的变性凋亡，采用缺氧预处理提高内源性EPO浓度，能够减少感光细胞的凋亡.但有关EPO对于视网膜光损伤时效性的研究报道较少.本实验通过手术显微镜光源制备大鼠急性视网膜光损伤模型，在不同时间点应用rHEPO进行干预治疗，观察视网膜组织形态的变化及Caspase-3蛋白表达情况，探讨rHEPO对大鼠急性视网膜光损伤的作用以及时效性.

1　材料和方法

1.1实验动物及分组

选取4周龄SD大鼠48只，雄性，体质量180～270 g，随机分成5组：正常对照组、模型对照组、模型治疗1、2、3组，其中正常对照组8只，其余各组均为10只.动物及实验使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》，大鼠在标准化饲养房内进行喂养(室温调节在21～24 ℃之间，空气流通，相对湿度55.0%)，昼夜明暗交替光环境适应1周.

1.2主要仪器和药品

手术显微镜(日本TOPCON OMS-50)；照度计(台湾泰仕TES-1339)；Caspas-3兔抗鼠多克隆抗体、免疫组化试剂盒(SP法)、浓缩型DAB试剂盒 (北京中杉生物工程有限公司)；多聚甲醛(常州市玉宇化工有限公司)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，产品批号：20131128)；乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，产品批号：20130715)；复方托比卡胺滴眼液(瑞眸舒，5 mL/支，长春迪瑞制药有限公司，产品批号：140602)；重组人促红素注射液(赛博尔，1.0 mL/3 000 IU/支，深圳赛保尔生物药业有限公司，产品批号：201408029)

1.3麻醉药及其配制

取水合氯醛10 g溶解于100 mL的生理盐水中，配制成10%的水合氯醛溶液，剂量为0.4 g/kg；取12.5 g乌拉坦溶解于50 mL的生理盐水，配制成25%的乌拉坦溶液；取50 mL 10%水合氯醛溶液与配制好的乌拉坦溶液50 mL 1∶1混合在一起，摇匀，混合液最终浓度水合氯醛为5%，乌拉坦为12.5%.剩余50 mL 10%水合氯醛溶液留作追加剂量时使用，每次实验前麻药均新鲜配制.

1.4造模及给药

对模型对照组及模型治疗组给予造模处理.光照前充分暗适应24 h，大鼠按5 mL/kg抽取上述1∶1混合麻药腹腔注射全麻，双眼用复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后置于手术平台上，垂直照射右眼(照射右眼时，左眼遮盖)，光照强度为(22 000±1 000) lux，距角膜距离为(150±3) mm，垂直照射大鼠瞳孔，照射时间为1 h，光照过程中确保角膜完全暴露，角膜间断滴生理盐水保持眼球表面的湿润.右眼照射结束后照射左眼，遮盖右眼.中途大鼠若有苏醒，用10%水合氯醛按4 mL/kg追加剂量1次,室温控制在21～24 ℃左右.全部照射完成后送入暗房暗适应24 h，最后送入标准化饲养房内正常喂养.模型治疗1、2、3组分别在光照前4 h、光照后立即、光照后3 d按照5 000 IU/kg腹腔注射rHEPO 1次,模型对照组无任何药物干预治疗.

1.5组织病理切片的制作及图像采集分析

光照后7 d处死动物，速取眼球，用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定24 h，常规石蜡包埋，采用石蜡切片机(莱卡2245)平行于角膜至视盘的矢状位连续切片，厚度4 μm.取通过视盘中央的切片，进行苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，观察视网膜各层的改变,并应用免疫组织化学的方法检测Caspase-3蛋白在视网膜中的表达.采用OLYMPUS BX51获取显微图像，应用Simple PCI图像分析系统进行图像分析.

1.6统计学处理

本研究使用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，采用方差分析的方法对计量资料进行统计学处理，取α=0.05为检验水准.

2　结　　果

2.1HE染色结果

正常对照组：正常大鼠视网膜各层结构层次分明，排列整齐，光感受器细胞内、外节界限清晰，内、外核层排列紧密，细胞核形态规整，染色均匀.模型对照组：视网膜光感受器内、外节排列紊乱，有空泡形成，部分断裂；外核层较正常对照组明显变薄，核间隙加大，部分有碎核现象；内核层也有部分碎核现象，厚度较正常对照组轻度变薄.模型治疗各组：视网膜光感受器内、外节排列紊乱，有小空泡形成；外核层较正常对照组有不同程度变薄，但好于模型对照组；内核层形态尚好，与正常对照组比较厚度无明显变化.见图1.各组外核层厚度见表1.

2.2Caspase-3表达结果

Caspase-3表达阳性表现为细胞质内有黄色或棕黄色颗粒.正常对照组视网膜内、外核层的细胞质内可见少许表达阳性的细胞；而模型对照组Caspase-3表达阳性的细胞在视网膜外核层的细胞质中呈弥漫分布，内核层也有部分棕黄色颗粒，较正常对照组表达明显增强(P<0.05)；模型治疗1、2、3组表达强度介于两者之间，且表达强度依次增强.应用图像分析系统进行平均吸光度测定，将切片的形态学表现转化为数字定量.见表1.

表1各组外核层厚度及Caspase-3的平均吸光度值

注：与正常对照组比较，*：P<0.05；与模型对照组比较，#：P<0.05；与模型治疗1组比较，&：P<0.05

3　讨　　论

多年来的研究表明：视网膜光损伤的机制主要包括热损伤、机械损伤和光化学损伤，其中光化学损伤是最常见的一种类型.大自然中的紫外线、可见光、日常用的灯及电子设备的荧光屏、眼科光学诊疗器械的光源等均可能引起视网膜光化学损伤.随着研究的深入，发现其主要的病理表现为视网膜感光细胞的凋亡.刘学政等[5]研究发现：视网膜外核层的面积和视细胞凋亡的变化规律具有相关性，视细胞凋亡的越多，外核层的面积越小.光损伤启动了视细胞的凋亡，后者导致外核层细胞核的丢失.本研究中模型各组的外核层厚度较正常对照组有不同程度的减少，也验证了这个结论.

细胞凋亡的发生与许多基因调控与表达有关，如bcl家族、P53基因、C-myc基因、Fas/Fas-L、半胱氨酸蛋白酶家族(Caspase)、凋亡前体Apaf-1、活性氧自由基ROS等，其中Caspase家族是细胞凋亡下游的关键酶，通常以无活性的蛋白酶原形式存在于细胞内.在氧化损伤、缺血低氧等诱导凋亡信号的刺激下，酶原被活化，并形成活化级联反应，通过次序激活Caspase蛋白，最终导致细胞凋亡.Caspase-3是下游的Caspase蛋白，大多数触发细胞凋亡的因素最终均需要通过Caspase-3介导的信号传导途径来实现[6].因此，Caspase-3是细胞凋亡的执行因子.Cong等[7]的研究发现：在视网膜光照60 min后，Caspase-3的表达增加，视网膜细胞表现出光毒性损害.

rHEPO是利用基因工程技术将人的红细胞生成素基因转入哺乳动物细胞内，高效表达的rHEPO能刺激红细胞生成一种酸性糖蛋白，与人体内天然分离的促红细胞生成素(EPO)相比，具有完全相同氨基酸排列序列，且与体内、外生物学活性基本一致[8].EPO主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成，改善人体的缺氧状态，临床上主要用于治疗肾性贫血.此外，EPO对中枢神经系统和视网膜具有显著的神经保护和修复作用.Rex TS等[9]在对视网膜色素变性大鼠的研究中发现：EPO能够减少神经元凋亡，发挥神经保护作用.王红云等[10]用自制光照箱(光照强度(6 000.0 ±106.9) lux)对大鼠视网膜进行光损伤制模，并通过腹腔注射rHEPO的方法进行治疗，通过观察发现：腹腔注射rHEPO对小鼠视网膜光损伤具有保护作用.

本研究中模型治疗1、2组的视网膜组织切片形态、外核层厚度以及Caspase-3表达虽然比正常对照组差，但较模型对照组均有不同程度的改善，而模型治疗3组与模型对照组无统计学差异，说明rHEPO对视网膜光损伤具有保护作用，并具有一定的时效性，早期用药效果好，其中光损伤前4 h预用药优于光损伤后立即用药.本研究结果显示：rHEPO对视网膜光损伤的保护机制可能与抑制Caspase-3的表达、减少细胞凋亡有关.

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【责任编辑：陈丽华】

Protective Effect and Timeliness of Recombinant Human Erythropoietin on Acute Retinal Light Injury in Rats

Huang Jingyan1,Yang Xi2

(1.Affiliated Hospital of Beihua University，Jilin 132011，China；2.LongtanDistrictMaternalandChildHealthHospital，Jilin132021，China)

Objective To observe the protective effect and timeliness of Recombinant Human Erythropoietin(rHEPO) on retinal light damage in rats.Method 48 rats with 4-week-old SD were randomly divided into 5 groups:normal control group，model control group，model treatment group 1，2，3；8 rats in normal control group and 10 rats in other groups.We used the light of surgical microscope to continuously irradiate the retina of SD rats in model groups to form the model of retinal light damage.RHEPO were given by peritoneal injection to model treatment group 1，2，3 according to the following time successively:4 hours before irradiation，immediately after irradiation，3 d after irradiation.All the rats were killed 7 days later and the eyes were excised.Hematoxylin eosin (HE) staining were applied to observe retinal changes.Immunohistochemistry methods were used to detect the expression of Caspase-3.Results Histology analysis:In normal control group，the retinal structure was complete and regular，and the staining was uniform.In model control group，the inner and outer segments of photoreceptor were arranged in disorder，the phenomenon of vacuolation and fracture were seen in outer segments.The outer nuclear layer became thinner(P<0.05),nuclear became denser and nuclear clearance became larger.rHEPO groups showed less damage than the model control group.There was significant difference between two groups except model treatment group 3 and model control group.Conclusion rHEPO is effective on repairing retinal light damage，but it has certain timeliness.Early intervention is more effective than later treatment，especially in 4 hours before light injury.

Recombinant Human Erythropoietin；retinal light damage；Caspase-3；apoptosis

1009-4822(2016)05-0628-04

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.05.015

2016-07-10

吉林市科技发展计划项目(201339028).

黄靖妍(1972-)，女，硕士，副主任医师，主要从事儿童斜弱视、屈光不正临床研究，E-mail：jccddn@163.com.

R775.9

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