健脾益气摄血颗粒对脾气虚型慢性免疫性血小板减少症血小板抗体及血清IL-2,IL-10与FOXP3表达的影响

吴玉霞，袁　忠,黄志惠,马西虎,费　飞



健脾益气摄血颗粒对脾气虚型慢性免疫性血小板减少症血小板抗体及血清IL-2,IL-10与FOXP3表达的影响

吴玉霞1，袁忠2,黄志惠1,马西虎1,费飞1

血小板减少；血小板；免疫学；白细胞介素2；白细胞介素10；DNA结合蛋白质类；中西医结合治疗

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是临床常见的一种自身免疫性疾病，以出血和血小板减少为主要特征，大约占临床出血性疾病的30%；其主要类型为慢性免疫性血小板减少症(chronic immune thromboaytopenia,CITP)，多见于成年女性，男女比例为1∶3。研究表明，ITP发病与细胞免疫和体液免疫功能紊乱导致血小板破坏过多和生成减少相关。中医从脾论治在治疗出血性疾病方面积累了丰富的经验，取得良好疗效[1-2]。因此，本研究观察健脾益气摄血颗粒对脾气虚型CITP血小板抗体及血清白细胞介素-2(IL-2),IL-10与FOXP3表达的影响，并初步探讨其作用机制。

1　对象与方法

1.1对象选取2013年8月—2015年10月血液科符合入选病例标准的CITP门诊及住院患者 40例，采用随机对照方法，即按随机化方法将入选患者分为健脾益气摄血联合强的松治疗组(20例)和单用强的松治疗对照组(20例)。其中，治疗组男性8例、女性12例，年龄(49.1±15.0)岁(16.5～78)岁；对照组男性9例、女性11例，年龄(48.5±16.0)岁(15.6～76岁)。2组患者性别、年龄及血小板计数情况比较,差别无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

纳入标准：(1)年龄16～78岁，性别不限；(2)符合CITP诊断标准[3]；(3)符合脾气虚证候诊断标准[4]；(4)血小板计数轻重分级为轻度至重度上限(24×109L-1)，出血程度为轻度至中度。排除标准：(1)合并严重心、脑、肝、肾疾病；(2)精神病患者；(3)妊娠期或哺乳期患者；(4)合并其他严重疾病如严重的糖尿病、高血压并发症患者；(5)已知对受试药物(单味)过敏者。

1.2方法

1.2.1治疗对照组：单用强的松，初始剂量按每天1～1.5 mg/kg，早8点顿服，治疗有效后可考虑减量，疗程为21 d；治疗组在与对照组使用相同强的松治疗基础上加服健脾益气摄血颗粒(配方：黄芪、党参、茯苓、白术、阿胶、茜草、炙甘草)，每次1袋，每日2次，疗程也为21 d。

1.2.2观察指标治疗前后2组血小板计数、骨髓产血小板巨核细胞数、血小板抗体、血清IL-2、IL-10及FOXP3 mRNA表达变化。

1.2.3检测方法(1)对照组和治疗组患者治疗前后抽取外周血，采用全自动血细胞分析仪(CD3700型,美国雅培公司)检测上述指标；(2)治疗前后采用骨髓穿剌方法采集骨髓做细胞形态学检验；(3)用流式细胞仪(FACS Calibur型,美国BD公司)分析治疗前后抗血小板抗体。(4)应用酶联免疫吸附法测定血清IL-10、IL-2水平，试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。(5)FOXP3 mRNA表达：治疗前后患者在清晨空腹状态下，抽取肘部5 mL静脉血液，取血清3 mL放入-80 ℃冰箱。采用荧光定量实时PCR测定，应用Trizol(美国Biomed公司)，反转录试剂盒(美国Fermantas公司),GAPDH及FOXP3上下游引物(上海生工生物工程公司合成)，根据GenBank中FOXP3和GAPDH基因序列应用Primer Premier 5.0软件分别设计FOXP3和GAPDH引物序列：

FOXP3(扩增产物180 bp):

上游引物:5′-GAGGAACTCTGGGAATGTG-3′

下游引物:5′-TGACCAAGGCTTCATCTGTG-3′

GAPDH(扩增产物145 bp):

上游引物:5′ -AGT-GGGTGTCGCTGTTGA-3′

下游引物:5′-GACCTGACCTGCCGTCTA-3′

荧光实时定量PCR试剂盒(QPS 201，上海东洋纺生物科技有限公司)，荧光实时定量PCR仪。

(MX 3005P，美国Stratagene公司)

1.4结果

1.4.12组患者治疗前后血小板计数、骨髓巨核细胞数及产血小板巨核细胞比较治疗后，对照组和治疗组血小板水平及产血小板巨核细胞数较治疗前均有提升(P<0.05)；但2组治疗后比较，治疗组优于对照组(P<0.05)，说明中药联合强的松治疗优于与单用激素治疗组(表1)。

1.4.22组患者治疗后血小板抗体比较治疗后，对照组和治疗组血小板抗体较治疗前均有降低，但对照组治疗前后比较差别无统计学意义(P>0.05)，而治疗组治疗前后比较,差别具有统计学意义(P<0.05)；2组患者治疗后血小板抗体比较差别有统计学意义(P<0.05，表2)。

表12组患者治疗前后PLT、产血小板巨核细胞数比较

Tab 1Comparisons of PLT、bone marrow generating platelet megakaryocyte number between two groups before and after treatment

n=20.PLT:血小板计数.同组内与治疗前比较，☆:P<0.05; 2组治疗后比较，★:P<0.05.

1.4.32组患者治疗前后血清IL-2,IL-10及FOXP3 mRNA表达比较对照组患者血清IL-2,IL-10及FOXP3 mRNA表达治疗前后比较差别无统计学意义(P<0.05)，治疗组治疗前后及与对照组治疗后比较差别有统计学意义(P<0.05，表3)。

表2　2组患者血小板抗体比较

n=20.PAIgG:抗IgG血小板相关抗体；PAIgA:抗IgA血小板抗体；PAIgM:抗IgM血小板抗体.同组内与治疗前比较，☆:P<0.05; 2组治疗后比较，★:P<0.05.

表3　2组治疗前后血清IL-2,IL-10及FOXP3 mRNA表达比较

n=20.IL-2:白细胞介素-2;IL-10:白细胞介素-10.同组内与治疗前比较，☆:P<0.05;2组治疗后比较，★:P<0.05.

2　讨　论

中医学认为，脾为后天之本，气血生化之源，且脾主统血，使血行脉中而不妄行。因此，按照中医学理论，“脾胃为后天之本，气血生化之源”与“脾统血”，其治疗以健脾益气摄血为治则，既能生血又可摄血，因此从脾论治脾虚型CITP取得良好疗效[5]，但其作用机制尚不明确。

ITP是一种以单纯性血小板减少为特征的获得性免疫性疾病，其发病机制复杂。现代研究表明，ITP既包括体液免疫失调，也包括细胞免疫紊乱，是一种具有异质性疾病。大量研究证实，血小板相关自身抗体产生与B细胞分化、增殖与体液免疫相关，它使外周血血小板寿命缩短及骨髓巨核细胞产血小板不良，引起血小板减少，加重自发性出血，临床检查可发现多数ITP患者存在血小板膜糖蛋白特异性抗体如抗GPⅡb/Ⅲa抗体和抗PIb/IX抗体[7-8]。在ITP发病过程中，参与ITP发病的细胞因子有两类，即Thl型和Th2型。Thl细胞能分泌IL-2，IL-3等，主要参与细胞免疫；Th2细胞分泌IL-3，IL-4，IL-10等，以IL-10为主要特征，主要参与体液免疫。有研究表明，在细胞免疫方面，ITP患者尚存在异常数量和功能CD4+CD25+Treg;CD4+CD25+Treg在机体中发挥抑制自身免疫增强免疫耐受作用，而控制CD4+CD25+Treg的主要基因则是FOXP3，它可在CD4+CD25+Treg内特异性地表达[9-10]。有研究证实，外周血FOXP3的表达在ITP患者中明显减少，而上调FOXP3表达可使患者骨髓象及临床表现明显改善，据此推断免疫耐受减低是由于FOXP3分子表达缺陷所致，这也为ITP发病的重要机制之一[11]。因此，可以通过观察药物能否通过调节细胞因子、上调FOXP3表达、抑制血小板抗体生成而达到调节细胞及体液免疫及促进骨髓巨核细胞成熟而发挥作用的。

健脾益气摄血颗粒方中黄芪、党参等为治疗气虚之主药，共为君药，白术补气健脾，茯苓渗湿健脾，共为臣药，阿胶、当归补血活血，共为佐药，茜草凉血祛瘀止血为使药。全方具有益气健脾摄血、止血祛瘀生新之功效。现代药理学研究证明，黄芪的主要成分为黄芪多糖，可使特异性免疫和非特异性免疫的能力增强，提高造血干细胞的增殖能力;党参具有调节细胞、体液免疫作用[12]；当归中具有当量多糖、阿魏酸，有增强免疫、诱生干扰素的功能[13]。茜草中的有效成分有茜草双酯，具有促进实验动物骨髓造血细胞增殖和分化作用，茜草尚有促进血液凝固达到止血作用[14]。本研究通过检测健脾益气摄血颗粒联合强的松治疗CITP前后血小板计数、产血小板巨核细胞数目、血小板抗体、血清IL-2,IL-10及FOXP3 mRNA表达的变化，试图初步探讨其作用机制。结果显示，单用强的松与健脾益气摄血颗粒联合强的松治疗前后均能提高患者的血小板水平，促进骨髓巨核细胞的分化成熟，具有增强机体免疫耐受、维持免疫平衡状态功能，但两组治疗后比较表明，健脾益气摄血颗粒联合强的松优于单用强的松，说明健脾益气摄血颗粒可能通过提高血清IL-2、IL-10水平，上调FOXP3 mRNA的表达，抑制自身反应性T细胞活化和抗体生成而达到减少血小板破坏，促进巨核细胞的成熟增加血小板生成而发挥作用。

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(编辑：常志卫)

2016-04-11

国家重点基础研究发展计划973项目(2013CB531705)

新疆医科大学 附属中医医院，新疆8300111.血液科;2.肾病科

吴玉霞(1967-)，女，副主任医师，中西医结合医学硕士.Email:wyxymkyz@163.com

R341；R341.3；R446.6；R558.2

B

1672-4194(2016)04-0264-03