阴离子交换色谱-荧光检测法测定人体血清中酪氨酸及其代谢产物

2016-10-15 11:37刘俊俊鄢爱平王晓芬万益群
分析科学学报 2016年2期
关键词:酪氨酸检出限波长

刘俊俊, 鄢爱平, 王晓芬, 郭 岚, 万益群*,

(1.南昌大学化学学院,江西南昌 330031;2.南昌大学分析测试中心,江西南昌 330047)

酪氨酸(Tyr)是20种用来合成蛋白质的蛋白氨基酸之一,它属于芳香族氨基酸,亦是人体的半必需氨基酸[1,2]。对羟苯基乳酸(PHPLA)、对羟苯基丙酸(PHPA)是Tyr的重要代谢产物,包含一系列的信号分子:神经递质、神经调节物质和营养因素。这些物质的分布和含量与人的行为、功能和病理状态等密切相关[3]。研究表明,Tyr的代谢异常可导致多种氨基酸代谢疾病[4,5]、神经系统变性性疾病[6]、恶性肿瘤[7,8]等。因此,对人体体液中Tyr及其代谢产物的研究,可在临床方面为疾病,特别是肿瘤的早期诊断和病理学研究提供重要的参考依据。

目前,Tyr的研究较为深入,但其代谢产物的研究相对较少。分析方法主要有分光光度法[9]、液相色谱法[10 - 12]、毛细管电泳法[13]、气相色谱法[14 - 16]等。离子色谱法(IC)因其灵敏度和分离效率高,且流动相简单、环保而备受关注。本文采用阴离子交换色谱-荧光检测法(IEC-FLD),系统地探讨了Tyr、PHPLA和PHPA的分离分析条件,建立了人体血清中上述三种化合物同时分析新方法,为Tyr及其代谢产物的临床研究提供了方法学参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ICS-2500型离子色谱仪(美国,Dionex公司),包括GP50四元梯度泵、LC25色谱柱箱、FLD-3000荧光检测器和Chemeleon6.8色谱工作站;F-4500型荧光光度计(日本,日立公司);Milli-QS超纯水装置(美国,Millipore公司);AP210电子天平(美国,Ohaus公司);MS2迷你振荡器(广州仪科实验室技术有限公司);TGL-16B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

酪氨酸(Tyr,纯度>99%)、对羟苯基丙酸(PHPA,纯度>98%),购于美国Acros Orgnics公司;对羟苯基乳酸(PHPLA,纯度>98%)购于美国Sigma公司;50% NaOH溶液(Sigma Aldrich)。实验用水为超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

1.2 血清样本的采集与处理

1.2.1血清样本的采集早晨7~8时,抽取人体空腹时静脉血5 mL(n=12,血样分别来源于南昌九四医院和北京大学深圳医院),置于采血管中,之后将所采血样于常温下3 000 r/min离心10 min,上层血清用于分析检测。

1.2.2血清样本前处理取血清500 μL于1.5 mL离心管中,加等体积的乙腈,之后于MS2迷你振荡器以3 000 r/min转速混匀1 min,室温静置10 min,再以12 000 r/min的转速离心10 min。取上清液,过0.22 μm水系滤膜后,进样分析。

1.3 色谱分析条件

色谱柱:IonPac AG21保护柱(50×2 mm),IonPac AS21分析柱(250×2 mm);柱温:35 ℃;淋洗液:4 mmol/L NaOH;流速:0.45 mL/min;进样体积:25 μL。荧光分析条件:激发波长277 nm,发射波长340 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离条件的选择

本文分别考察了AS18阴离子交换柱(IonPac AS18)与AS21阴离子交换柱(IonPac AS21)对目标物的分离情况。采用IonPac AS18分离柱,流动相为30 mmol/L NaOH溶液,三种物质分离良好,保留时间在20 min之内,但分析物荧光响应信号较弱;IonPac AS21分离柱较IonPac AS18分离柱对各物质的保留能力弱,NaOH溶液浓度为4 mmol/L时,各物质已完全分离,且荧光信号增强,因为三种物质对pH值的变化比较敏感,pH值增大,物质的荧光响应降低,如图1所示。因此,本文选择IonPac AS21分离柱、4 mmol/L NaOH溶液对目标化合物进行分离。同时考察了淋洗液流速对目标物分离效果的影响。结果表明,流速增大,物质的出峰时间缩短,且信号响应也相应增强,在柱压允许范围内,本文选定流速为0.45 mL/min,三种分析物在20 min内完全分离。在优化条件下,Tyr、PHPLA和PHPA色谱分离图见图2。

2.2 荧光波长的选择

配制Tyr、PHPLA和PHPA浓度均为1.0 mg/L溶液,在荧光光度计上对各物质的激发和发射光谱进行扫描,得到各物质的最大激发和最大发射波长分别为λex=277 nm、λem=306 nm。但因为该激发和发射波长比较接近,Raleigh散射现象较为严重,使得离子色谱中噪音较高,灵敏度降低。若增大发射波长,可以降低噪音,但物质的荧光强度减弱,检出限也发生了相应变化。实验中固定激发波长λex=277 nm,对不同发射波长(λem)条件下各物质的检出限做了比较,结果如图3所示。结果表明,当λex=277 nm、λem=340 nm的条件下各物质的检出限相对较低。

2.3 样品前处理条件的选择

人血清中含有大量蛋白质,如果直接进样分析会影响色谱柱柱效及其寿命[17],故去除血清中的蛋白质很有必要。本文分别考察了甲醇和乙腈沉降蛋白的效果。结果表明:以甲醇为沉淀剂,沉降蛋白效果较差;以乙腈为沉淀剂,蛋白质除去较为完全,满足实验要求。因此本实验选择乙腈为血清蛋白沉淀剂。

2.4 干扰实验

2.5 线性方程、线性范围和检出限

配制一系列不同浓度的Tyr及其代谢产物混合标准工作溶液,在已优化的色谱分析条件下,以峰面积(A)对浓度(c)进行线性拟合,结果见表1。结果表明,Tyr、PHPLA和PHPA分别在0.30~25 mg/L、0.025~2 mg/L和0.025~2 mg/L的范围内线性关系良好,测得三种物质的检出限(以S/N=3计)分别为0.024 mg/L、0.020 mg/L、0.019 mg/L。

表1 酪氨酸及其代谢产物的线性方程、相关系数及检出限

2.6 回收率和精密度

为了考察方法的准确度及精密度,在乳腺癌患者血清样品中添加了3个不同水平的Tyr、PHPLA和PHPA混合标准溶液进行加入回收试验,每个水平平行测定6次,结果见表2。三种物质的加标回收率在72.6%~99.1%之间,相对标准偏差(RSD)在1.27%~6.62%之间,表明该方法准确可靠,可满足实际样品的测定要求。

表2 血清样品加标回收结果(n=6)

ND:not detected.

2.7 样品测定

应用所建立的分析方法,对健康人血清(1号)、脑梗死合并肺部感染患者血清(2~4号)、重度营养不良患者血清(5号)、乳腺癌患者血清(6~12号)进行分析,结果见表3。结果表明,在脑梗死患者及部分乳腺癌患者血清中检测到PHPLA,图4为9号血样以及血样加标的色谱图。

表3 人体血清中酪氨酸及其代谢产物分析结果(n=3)

ND:not detected.

3 结论

本文应用离子色谱-荧光检测技术,建立了人体血清中酪氨酸及其代谢产物同时分析新方法。该方法色谱流动相组成相对简单、环保,且样品前处理简便。通过样品加标回收实验,证明所建立的方法能够满足实际血清样品检测需求,可为酪氨酸及其代谢产物的临床应用研究提供方法学参考。

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