硝酰基荧光探针与牛血清白蛋白相互作用的研究

2016-10-15 11:37曾晓丹朱宝存
分析科学学报 2016年2期
关键词:残基色氨酸常数

曾晓丹, 姜 城, 朱宝存

(1.吉林化工学院分析测试中心,吉林吉林 132022;2.中国石油吉林石化公司电石厂,吉林吉林 132022;3.济南大学资源与环境学院,山东济南 250022)

血清白蛋白(Serum Albumin,SA)是动物血液循环体系中最丰富的蛋白之一,它具有多个配位基团,起着运输和沉积内源或外源小分子的作用[1]。由于其生物功能与其特定的结构密切相关,因此广泛应用于生化、生理、医学以及生物工程等学科。各种物质与血清白蛋结合方面的研究仍处于热点[2,3]。物质进入血液循环后,通过血浆的储存和运输到达目标位置。研究各种物质与血清白蛋白之间的相互用,有助于了解物质在体内的运输和分布情况,对于阐明目标物质的作用机制具有重要意义。硝酰基(HNO)是NO去单电子形式,NO或硝酸盐所产生的HNO在体内对心血管活动作用非常明显,同时可以作为心衰的一种新型治疗手段[4]。

本文应用近年报道合成的检测HNO的荧光探针(4-[2-(diphenylphosphino)benzoate]-N-butyl-1,8-naphtalimide,NIM)[5],研究该探针与牛血清白蛋白的相互作用。在模拟生理条件下,运用紫外吸收光谱、荧光光谱、傅里叶红外光谱和CD光谱研究了探针与牛血清白蛋白的相互作用,探讨了探针对牛血清白蛋白构象的变化,获得了荧光猝灭常数、结合常数以及相互作用的热力学常数,并确定了结合距离以及结合力。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Cary Eclipse荧光分光光度计(美国,Varian公司);UV-2550紫外分光光度计(日本,Shimadzu公司);Tensor 27 傅立叶变换红外光谱仪(德国,Bruker公司),CaF2窗口附件;Jasco-810 圆二色谱(日本,Jasco公司)。

BSA(美国Sigma公司),用二次蒸馏水配成1.0×10-4mol·L-1储备液,存于4 ℃冰箱中;探针NIM用乙醇配成1.0×10-3mol·L-1储备液。其他所有试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

移取适量的BSA、NIM储备液,以pH=7.40 Tris-HCl缓冲溶液定容至5 mL。BSA的最终浓度为2 μmol·L-1,而探针的浓度范围为0~10 μmol·L-1。测定溶液的溶剂体系为乙醇∶水=0.5∶9.5(V/V)。将测定溶液摇匀静置。

1.2.1荧光光谱在激发波长为280 nm,激发和发射狭缝均为5 nm的条件下,扫描荧光光光谱。

1.2.2同步荧光光谱分别设定△λ=15 nm和60 nm,记录220~320 nm范围内的同步荧光光谱。

1.2.3三维荧光光谱在激发波长为270 nm,步长10 nm的条件下,扫描三维荧光光谱。

1.2.4紫外吸收光谱以Tris-HCl缓冲溶液为参比,扫描200~500 nm范围内的紫外吸收光谱。

1.2.5红外光谱在4 cm-1分辩率下扫描64次,在1 800~1 400 cm-1范围内扫描红外光谱。

1.2.6CD光谱使用0.1 cm石英池,在200~350 nm范围内扫描BSA与探针混合前后的CD光谱,同时以Tris-HCl缓冲溶液为参比。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

图1为探针对BSA的荧光猝灭图。随着探针浓度的增加,BSA荧光强度逐渐降低。表明探针与BSA分子发生了相互作用并形成了复合物,使BSA分子中的氨基酸残基的微环境发生了变化[6]。

荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭两种,这两种猝灭的主要区别在于猝灭常数与温度关系不同。静态猝灭常数将随温度的升高而减小,而动态猝灭常数将随温度的升高而增大。

根据Stern-Volmer方程[7]:

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中,F0为未加入化合物时的荧光强度,F为加入化合物后BSA的荧光强度,Kq为荧光猝灭常数,τ0为荧光分子平均寿命(生物),分子平均荧光寿命一般为10-8s,KSV为猝灭常数,[Q]为化合物浓度。

将荧光强度按式(1)处理,结果列于表1。由表1 可见,猝灭速率常数Kq远远大于动态猝灭KSV值2.0×1010L·mol-1·s-1,而且随着温度的升高而减小,因此探针对BSA的荧光猝灭属于静态猝灭。探针与BSA形成基态复合物,引起蛋白质分子内源性荧光的猝灭。

表1 NIM-BSA在不同温度下的猝灭常数、结合常数和结合位点数

2.2 探针与BSA的结合常数与结合位点数

对于静态猝灭,探针与BSA的结合常数与结合位点数可由以下式[8]得到

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(2)

以lg[(F0-F0/F)对lg[Q]作图,由斜率以及截距可求得结合常数和结合位点数(表1)。由表1的结果可以看出,探针与BSA之间有较强的结合作用,并且n近似等于1,说明探针与BSA有一个结合位点。BSA中含有两个色氨酸,分别位于134和212位。由于134位色酸处于亲水环境中发生了荧光猝灭,因此NIM很可能对与位于sub-domain ⅡA 中的212位的色氨酸相结合。

2.3 探针与BSA之间结合距离的计算

根据Föster的偶极-偶极无辐射能量转移理论[9],将BSA的荧光光谱与探针的吸收光谱重叠,采用矩形分割法求出光谱重叠区域的积分值J(3.42×10-14cm3·L·mol-1),求出R值(3.31 nm),可求得E(0.259) 和r(3.73 nm)值。计算得到的探针与BSA中氨基酸残基的距离r为3.73 nm,小于最大距离7 nm,表明探针与BSA之间存在非辐射能量转移。

2.4 探针与BSA的作用力类型

化合物和生物体内蛋白质分子间的结合力主要有范德华力、静电引力、疏水作用力和氢键等[10]。作用力类型可根据结合过程的热力学参数确定。当△H>0、△S>0,结合过程中疏水力占主导;当△H<0、△S>0时,静电作用占主导;而当△H<0、△S<0时,主要是范德华力和氢键占主导作用。将计算求得的热力学参数列于表1,由表中的数据可得△G<0,说明结合反应可自发进行。由△H<0、△S>0说明它们之间的主要作用力是静电作用[11]。

2.5 探针在BSA上结合位置的确定

由于酮洛芬(Ketoprofen)和布洛芬(Ibuprofen)对BSA 的SiteⅠ和SiteⅡ能分别发生特异性结合并且结合作用较强,所以可以根据BSA结合位点上酮洛芬或布洛芬的置换作用确定探针与BSA的结合位置。根据式(3)计算荧光比率[12]:

Binding=F/F0

(3)

将荧光比率对探针与BSA浓度比作图,见图2。由图中可知,随着酮洛芬的浓度的增加,体系中的F/F0有明显的降低,而加入布洛芬的体系的荧光变化很小,说明探针被酮洛芬从BSA的结合位点置换下来,即结合在BSA的ⅡA子域上(SiteⅠ)。

2.6 探针对BSA构象影响

2.6.1同步荧光光谱由图3可以看,色氨酸与酪氨酸残基的最大发射峰峰形没有发生变化,但荧光强度均有所降低,并且色氨酸荧光降低的程度(60%)要大于酪氨酸残基(37.5%)。表明该探针的加入导致BSA的构象发生变化,并且主要与色氨酸的残基发生了作用。

2.6.2三维荧光光谱扫描BSA加入探针前后的三维荧光谱图,得到谱图见图4。由图可看出,加入探针后,最大荧光发射波长发生发变化(红移了2 nm),而且荧光强度值发生明显降低,因此探针与BSA作用前后三维荧光光谱发生明显变化。说明了加入探针后,BSA的荧光被猝灭,并且氨基酸残基周围的微环境也发生了变化,使BSA的多肽链结构发生了变化[13]。

2.6.3红外光谱蛋白质红外光谱的酰胺Ⅰ带主要是其氨基酸残基C=O伸缩振动吸收,各二级结构与羰基和氨基间形成的氢键有关[14]。从图5中可以看出,探针与BSA作用后,使BSA的酰胺Ⅰ带的最大吸收峰从1645 cm-1移动到了 1643 cm-1,说明探针与BSA发生了结合作用,而且这种结合对BSA的二级结构有一定的改变。

2.6.4CD光谱运用CD法研究了探针与BSA相互作用的情况(图6)。由图中可以看出加入探针后,BSA 的CD光谱形状没有变化,但是随着探针浓度的增加,特征峰处的光谱强度却发生了明显的变化。计算结果表明,探针的加入使得BSA的α-螺旋结构的含量由56.11% 转化为43.36%,进一步表明探针与BSA发生了作用并使BSA的构型发生了一定的变化[15]。

3 结论

研究结果表明,探针与BSA具有较强的结合作用,并引起BSA内源荧光的猝灭。静电引力是二者结合的主要作用力。探针在BSA中只有一个结合位点,位于BSA的亚结构域ⅡA处(SiteⅠ),该结合位点与色氨酸残基间的距离3.73 nm。探针NIM的加入使BSA的构象发生了变化。该研究结果为今后研究探针在生物体内储存、运输和检测机理提供了重要信息。

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