竹荪加工中废弃物多糖水解液的胶束毛细管电泳研究

白新伟*, 王毅红， 陈定梅， 田 玲

(六盘水师范学院化学与化学工程系，贵州六盘水 553004)

竹荪(Dictyophoraindusiata)别名“竹笙”，隶属真菌门，是主要分布在我国贵州、云南等高山地区寄生在枯竹根部的名贵食药两用菌[1]，含有丰富的氨基酸[2]、多糖[3]、维生素，有 “真菌之花”、“菌中皇后”的美誉。竹荪子实体由菌盖、菌裙、菌柄、菌托组成，由于菌托和菌盖口感较差，在采收或加工商品竹荪过程中被丢弃[4]，而菌托约占竹荪鲜重的55%，菌盖为鲜重的11%，即每生产出1 000 g的鲜商品竹荪，就有1 680 g的菌托和331 g的菌盖被丢弃，造成该珍贵食用菌资源的巨大浪费。

竹荪多糖为具有生物活性的大分子物质，在抗炎症[5]、抗肿瘤[6]、刺激免疫[7]、抗氧化[8]等方面都有显著疗效。以往对竹荪多糖的研究主要采用气相色谱[9]、液相色谱[10]和DNS比色法[11]对竹荪子实体整体处理分析，或将研究局限在可食的竹荪菌柄和菌裙部分，缺少对竹荪不同部位多糖差异的对比分析，特别是缺乏对竹荪加工中废弃的菌托和菌盖研究数据，不利于合理利用竹荪资源。毛细管电泳作为一种快速、高效的新型分离分析技术[12]，在生物医药领域显示了广泛的应用前景。目前毛细管电泳法对植物细胞多糖的研究主要集中在茯苓[13]、防风[14]、藏红花[15]等中药材上，对竹荪的研究较少。

本研究采用1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮对糖类物质进行柱前衍生，克服了传统的还原氨化衍生法[16]存在的诸如反应时间长，不稳定基团易引起测定偏差等缺点。本实验与Honda等[17]采用的单糖衍生试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮相比,采用的衍生试剂衍生化条件更为温和，产物更稳定，灵敏度更高。同时本研究采用胶束毛细管电泳分离模式分别对竹荪菌子实体四个部位多糖水解液的单糖进行了定性定量对比分析，9 min内实现了样品的快速高效基线分离分析。据此提出竹荪加工废弃物菌盖、菌托综合利用的可能性，以期为该资源的综合利用提供基础数据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

毛细管电泳仪(美国，Agilent公司)；弹性石英毛细管：58.5 cm×50 μm i.d.(河北永年光纤公司)。

单糖标准品：葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)，1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，十六烷基硫酸钠(SDS),十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)。

1.2 实验方法

1.2.1标准溶液的配制称取1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮0.080 g，定容至10 mL，浓度为5.0×10-2mol/L。准确称取葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖标准品，配制成单糖浓度均为1.0×10-2mol/L的混合标准溶液。

1.2.2竹荪样品处理将竹荪样品按照菌盖、菌裙、菌柄、菌托四个部位分类切割，并分别提取各部位多糖。多糖提取沿用香菇多糖的提取工艺，主要步骤为：干燥，研细热水抽提，过滤，浓缩，Seveg法脱蛋白，乙醇沉淀，丙酮及无水乙醇分级洗涤竹荪多糖制品。取上述竹荪多糖5 mg，加2 mol/L的三氟乙酸1 mL，封口后于100 ℃下水解9 h，菌盖、菌裙、菌柄、菌托多糖水解液分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号，冷却后用氮气吹至近干，用水溶解定容至1 mL，备用。

1.2.3衍生依次向安培瓶中加入100 μL 5.0×10-2mol/L衍生试剂PMP和10 μL多糖水解液，10 μL氨水，密封，于温度80 ℃水浴中反应40 min，取出用氮气吹至近干，加1 mL乙腈溶解后，备用。

2 结果与讨论

2.1 电泳分离条件的优化

2.1.1缓冲溶液的选择考察了邻苯二甲酸盐、乙酸-乙酸盐、磷酸盐和硼酸盐缓冲体系，发现糖类衍生物在硼酸盐缓冲体系中分离效果最好。固定其他条件不变，考察了硼酸盐在15～30 mmol/L时糖类衍生物的分离效果，发现硼酸盐浓度为25 mmol/L时，迁移时间较短，分离效率较高。选用能获得最佳分离效果且时间相对较短的硼酸盐溶液浓度为25 mmol/L；调节缓冲溶液pH值为9.0～9.6，实验结果表明，当pH为9.4时，分离效果最佳。进一步提高pH值，分离效率效果不明显且极线漂移严重不利于分析测定。综合考虑，选择缓冲溶液pH为9.4。

2.1.2表面活性剂的影响选择适当的表面活性剂可以起到改善电渗流[18]，提高分离效果的作用。实验比较了CTAB、SDS两种表面活性剂对分离的影响，加入表面活性剂CTAB对分离没有明显作用，加入表面活性剂SDS，出峰时间明显提前，峰形改善明显，但是高浓度的SDS导致基线噪音增加。实验选择SDS浓度为20 mmol/L。

2.1.3分离电压的影响实验比较了电压在12～16 kV时对分离的影响。结果表明随着分离电压的增大，迁移时间明显缩短，分离度有所增加；但分离电压过高，电流增大，产生较大的焦耳热，尽管缩短了分析时间，但组分间的分离度相应变差。综合整体的分离情况，本文选择的分离电压为15 kV。

2.1.4温度对分离的影响维持恒定的毛细管温度对于逸散毛细管电泳分离过程中产生的焦耳热、改善分离都有一定的作用。在温度为25～30 ℃范围内，比较了不同温度下单糖的分离情况。结果发现，温度的变化对分离度的影响不大。为防止温度过高产生较大的焦耳热影响分离效果，选择分离温度为25 ℃。

2.2 方法验证

配制系列浓度的单糖混合标准溶液，分别进行衍生化及电泳分析，并以单糖的浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归。结果表明：在5～100 μmol/L线性范围内，峰面积和每种分析物浓度之间有很好的相关性。在信噪比为3的基础上，5种分析物的检出限为0.81～1.60 μmol/L。各单糖的分析特性见表1。

表1 单糖的线性方程、相关系数、线性范围及检出限

在最优化条件下，对单糖标准品衍生液的迁移时间和峰面积重现性进行考察，结果表明各单糖峰面积相对标准偏差(RSD，n=6)均小于2.6%，迁移时间RSD均小于1.8%，表明方法的重现性较好。

为验证该方法的精确性，用标准加入法向竹荪实际样品加标，按1.2方法衍生化，在最优化条件下做回收率实验，平行三次实验，各单糖回收率在94.3%～103.4%之间，结果显示该方法对于上述分析物的同时测定是比较准确的。

2.3 方法应用

按前述优化条件，对单糖衍生物标准品进行胶束毛细管电泳分离，结果见图1。竹荪多糖水解液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ按1.2方法衍生化，典型电泳谱图见图2(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。采用标准加入法，将实际样品各检出峰迁移时间与标准品电泳图谱进行对比定性：竹荪菌盖、菌柄多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖组成。由表2可知：在商品竹荪加工过程中丢弃的菌盖的多糖中葡萄糖含量分别是商品竹荪的可食菌体部位(菌裙和菌柄)的3.7和1.1倍，甘露糖是其2.5和1.3倍，半乳糖是其3.5和2.2倍；而丢弃的菌托的多糖中单糖含量更是远远超过了菌裙和菌柄(除菌托中半乳糖与菌柄中含量相当外)，具体含量差距为：葡萄糖含量是菌裙和菌柄的4.3和1.3倍，甘露糖是其4.9和2.6倍，半乳糖是其1.5和0.95倍。据此可对菌托、菌盖进行综合利用。

CarbohydratesContent(mmol/g) PileusAnnulusStipeVolvaGlc0.710.190.650.82Ara00.0900.12Man0.350.140.270.69Fuc0000Gal0.730.210.340.32

3 结论

胶束毛细管电泳法对糖类物质分离检测的方法，具有线性范围宽、重现性好等特点，可用作竹荪中多糖组成测定的常规方法。同时，通过对竹荪菌子实体四个部位多糖水解液对比分析可知，作为竹荪加工废弃物的菌盖多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖组成，菌托多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，两种废弃物多糖含量均超过竹荪菌可食的菌裙和菌柄部分。