响应面法优化酶法提取羊肚菌菌柄多糖工艺研究

刘书彤，吴 磊，刘兆昱，朱振元

（天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

羊肚菌（Morchella esculenta）作为一种可食用、可药用、鲜嫩可口的野生真菌，主要生长于潮湿的阔叶林地上，由于其形态酷似羊肚而得名[1]。《本草纲目》 中对于羊肚菌有这样的记载：“甘寒无毒，益肠胃，化痰利气，补脑提神”[2]。现代医学的研究表明，其含有的活性成分，能够调节肠道稳态[3]，具有抗疲劳[4]、抗氧化[5]、抗菌[6]、保肝、护肝[7]等功效。

目前，野生羊肚菌的生长条件对气候、温度、湿度、土壤等多种外界环境条件要求高，产量较低，致使羊肚菌在市场上供不应求、造成价格居高不下的局面。供应到市场上的羊肚菌需要满足地方等级规格和出口外销的质量标准，主要以全剪柄精品（pileus of Morchella esculenta，PME）为主，需要将3～5 cm 长的菌柄裁剪[8]，致使我国每年会产生数以万吨的羊肚菌下脚料，造成资源浪费。有研究表明，羊肚菌菌柄富含多糖[9]、矿物质元素[10]、不饱和脂肪酸[11]、氨基酸[12]、维生素[13]、多酚[14]等多种活性成分，但羊肚菌菌柄的细胞组织结构紧密，由果胶、几丁质、纤维素等多种成分组成，一般的物理方法难以破坏细胞组织。通常采用热水浸提法，稀酸、稀碱提取法等，张景等人[15]采用传统水提醇沉方法羊肚菌子实体多糖得率为6.69%，虽然简单易操作，但是提取温度高易造成能源浪费；稀酸、稀碱提取法测得羊肚菌多糖得率分别为10.74%，5.04%，但存在容易破坏其活性成分结构等问题[16]。酶法提取多糖具有反应条件温和、安全无毒且能够减少原料和试剂的消耗等优点，从而降低成本；果胶酶能够破坏植物细胞壁，使细胞内活性成分流出溶解从而提高得率[17]。

以裁剪掉的羊肚菌菌柄为原料，使用酶法对羊肚菌菌柄进行提取工艺优化，以提高多糖得率，探究在何种条件下多糖的得率最优，对羊肚菌下脚料进行高值化开发，以期为羊肚菌菌柄在食品、保健品、药品等领域的深加工提供理论依据，为乡村振兴提供绿色动力。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

羊肚菌菌柄，贵州省榕江盘正农业有限公司提供；果胶酶（50 kU/g）、纤维素酶（20 kU/g）、木瓜蛋白酶（200 kU/g），绵阳鑫奥科生物科技有限公司提供；标准葡萄糖溶液（0.1 mg/L），上海源叶生物科技有限公司提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高速粉碎机，永康市圣象电器有限公司产品；分析天平，爱来宝生物技术有限公司产品；pH 计，德国Sartorius 公司产品；加热搅拌水浴锅，天津欧诺仪器仪表有限公司产品；离心机，上海安亭科学仪器厂产品；紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；冷冻干燥机，上海纵科实业有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将购得的羊肚菌菌柄在40 ℃条件下烘干6 h 后粉碎，过100 目筛，即得羊肚菌菌柄粉末，加入酶进行酶解后，于95 ℃条件下灭酶，以转速4 000 r/min离心15 min，取上清液加入4 倍体积无水乙醇，低温静置过夜，然后以转速4 000 r/min 离心15 min，弃上清液，加入蒸馏水溶解沉淀，冻干即得羊肚菌菌柄粗多糖[18]。

1.3.2 不同酶的选取

称取4 份羊肚菌菌柄粉末0.50 g，1 组不添加酶作为空白对照，其余3 组分别加入果胶酶0.05 g，纤维素酶0.05 g，木瓜蛋白酶0.05 g；调节pH 值4.0，于45 ℃条件下酶解2 h，试验5 次，比较不同酶对羊肚菌菌柄多糖得率的影响。

1.3.3 羊肚菌菌柄多糖得率测定

结合硫酸-苯酚法[19]测定初始提取物中羊肚菌菌柄多糖的含量。

（1）标准曲线的绘制。分别吸取质量浓度0.1 mg/L的标准葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 置于试管中，加蒸馏水补至1 mL，再分别向每个试管中加入6%的苯酚溶液溶液1.0 mL 和浓硫酸溶液5.0 mL，并充分混匀，静置10 min，放入30 ℃水浴锅中水浴20 min，冷却至室温后，于波长490 nm 处测定吸光度。最后，以葡萄糖质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。得到的标准曲线线性回归方程为Y=10.991 4X+0.012 1，相关系数R2=0.999 2。

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

（2）多糖得率的测定。提取的多糖按照上述方法测定吸光度，按下式计算得率[20]：

式中：W——羊肚菌菌柄多糖的得率，%；

C——测得羊肚菌菌柄多糖的质量浓度，mg/mL；

V——定容体积，mL；

N——稀释倍数；

M——称取的样品质量，g。

1.3.4 羊肚菌菌柄多糖酶解条件工艺优化

（1）单因素试验。①酶添加量对酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影响。称取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶解时间1 h，酶解温度45 ℃，酶解pH 值4.0，考查不同酶添加量（0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%）对酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影响。②酶解时间对酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影响。称取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解温度45 ℃，酶解pH 值4.0，考查不同酶解时间（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h）对酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影响。③酶解温度对酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影响。称取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解时间1 h，酶解pH 值4.0，考查不同酶解温度（40，45，50，55，60 ℃）对酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影响。④酶解pH 值对酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影响。称取羊肚菌菌柄粉末0.50 g，按照酶添加量1.2%，酶解时间1 h，酶解温度45 ℃，考查不同酶解pH 值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5）对酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的影响。

（2）响应面优化设计。基于单因素试验的结果，采取Box-behnken 中心组合试验设计。

试验设计因素与水平设计见表1。

表1 试验设计因素与水平设计

1.4 数据分析

采用Excel 分析数据，Origin Pro 2019 作图，SPSS 27 进行显著性分析，利用Design Expert 13 进行响应面试验的设计及优化分析。

2 结果与分析

2.1 不同酶种类对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

酶种类对羊肚菌菌柄多糖得率的影响见图2。

图2 酶种类对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

由图2 可知，在一定的提取条件下，加入酶后可以相对提高羊肚菌菌柄多糖的得率，果胶酶组多糖得率最高，为6.35%，是由于果胶酶可以有效地将果胶等大分子物质分解成小分子，增加活性成分的释放[21]。因此，试验选用果胶酶进行酶解。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶添加量对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

酶添加量对羊肚菌菌柄多糖得率的影响见图3。

图3 酶添加量对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

由图3 可知，随着酶添加量的增加，羊肚菌菌柄的多糖得率先增大后减小。当酶添加量达到1.0%时，多糖得率为4.53%（p＜0.05）。可能是由于增大酶浓度可以使酶与底物更加充分接触，酶解效果提高，多糖得率增加；当酶添加量大于1.0%时，多糖得率有所下降，可能是由于酶添加量增加部分多糖发生降解作用，导致多糖得率降低[22]。因此，确定酶添加量为1.0%。

2.2.2 酶解时间对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

酶解时间对羊肚菌菌柄多糖得率的影响见图4。

图4 酶解时间对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

由图4 可知，当酶解时间低于1.5 h 时，酶与底物未能充分反应完全，1.5 h 时得率达到最大为5.39%（p＜0.05），随酶解时间的延长，羊肚菌菌柄多糖得率逐渐减小，可能是由于酶解时间过长会引起多糖炭环裂解结构发生变化，或是其他水溶性成分的溶出干扰了测定，导致多糖含量降低[23]。

2.2.3 酶解温度对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

酶解温度对羊肚菌菌柄多糖得率的影响见图5。

图5 酶解温度对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

由图5 可知，随着酶解温度的升高，羊肚菌菌柄多糖得率先上升后下降，在45 ℃时达到最大值，为6.91%（p＜0.05）。可能是由于酶对温度变化较敏感，温度过低时酶的活性未被激活；温度升高时酶变性而失活，降低了酶与底物的反应，导致酶解产物减少[24]。因此，选取45 ℃为最适酶解温度。

2.2.4 酶解pH 值对羊肚菌菌柄多糖得率的影响

由于不同酶的最适pH 值不同，因此酶的活性也受pH 值的影响[25]。

酶解pH 值对多糖得率的影响见图6。

图6 酶解pH 值对多糖得率的影响

由图6 可知，随着酶解pH 值的上升，多糖得率先升后降，在酶解pH 值4.0 时达到最高值，为5.82%（p＜0.05）；酶解pH 值低于4 时，酶与底物的反应不充分；酶解pH 值高于5 时，可能酶的空间结构受到破坏，进而引起酶的活性和酶构象发生变化[26]。因此，羊肚菌菌柄多糖提取最佳酶解pH 值为4。

2.3 响应面分析法试验结果

2.3.1 Box-behnken 试验设计及结果

根据单因素试验结果，在影响羊肚菌菌柄多糖得率的4 个因素中分别选取3 个水平进行编码（表1）。

响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

2.3.2 回归模型的建立及方差分析

利用Design Expert 对表2 试验结果进行多元回归拟合，得到酶提羊肚菌菌柄多糖提取率的回归方程：

回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验见表3。

表3 回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验

由表3 可知，该模型显著（p＜0.000 1），失拟项p=0.053 1＞0.050 0，不显著。R2=0.965 1，表明该模型可以较好地反映酶解羊肚菌菌柄提取多糖过程中各影响因素与响应值的关系并预测最佳条件。4 个因素对羊肚菌菌柄多糖得率影响的主次顺序为B＞C＞A＞D，即酶解时间＞酶解温度＞酶添加量＞酶解pH 值。

2.4 Box-behnken 响应面图分析

曲线趋势图通过将4 个因素中任意2 个因素固定为零水平，以反映两两交互作用对羊肚菌菌柄多糖得率的影响。

各因素对羊肚菌菌柄多糖得率影响的响应面图和等高线图见图7。

由图7 可知，结合曲线趋势图及等高线图反映出酶解时间对羊肚菌菌柄多糖得率的影响更显著，与方差分析的结果一致。经响应面模型分析得到酶提羊肚菌菌柄多糖的最佳条件为酶添加量0.980 2%，酶解时间1.397 3 h，酶解温度43.820 8 ℃，酶解pH值3.967 8，此时羊肚菌菌柄多糖得率为7.133 8%。为方便操作，将羊肚菌菌柄多糖的提取条件修正为酶添加量1%，酶解时间1.5 h，酶解温度45 ℃，酶解pH 值4。在此条件下，进行5 次验证试验，测得羊肚菌菌柄多糖的平均得率为7.12%。

3 结论

以羊肚菌菌柄下脚料为试验原料，在单因素试验筛选基础上，利用Box-behnken 响应面优化酶法提取羊肚菌菌柄多糖的工艺技术，获得最佳提取工艺参数为复合酶添加量1%（以底物质量计），酶解时间1.5 h，酶解温度45 ℃，酶解pH 值4，在此工艺参数下其得率为7.12%，接近模型预测的提取值。使用该工艺处理羊肚菌下脚料多糖得率与子实体接近，提高活性物质得率的同时避免了资源浪费。试验验证了果胶酶提取羊肚菌菌柄多糖具有可行性，为进一步对羊肚菌菌柄下脚料的综合利用及高值化开发提供科学理论依据，为乡村振兴提供绿色动力。