南瓜黄色素阻断亚硝胺合成与抑菌活性研究

赵二劳，杨勤帅，郝丽琴，赵三虎

(忻州师范学院化学系，山西忻州 034000)

亚硝胺是当前最令人关注的一类化学致癌物，它能引起人和动物多种组织器官病变或恶性肿瘤[1,2]，严重影响人体健康。迄今，尚未发现人和动物能依靠自身机体功能抵抗和防御亚硝胺的致癌作用[3]。正常情况下，人们直接从食物中摄入的亚硝胺甚少，但形成亚硝胺的前体物质亚硝酸盐却大量存在于食物中，极易通过食物链进入人体。进入人体的亚硝酸盐在胃液条件下很适宜合成亚硝胺[4,5]。因此，清除体内亚硝酸盐以及阻断亚硝胺在人体内的合成是防癌抗癌的有效途径。在人们日益关注自身保健的今天，研究食物清除亚硝酸盐以及阻断亚硝胺合成是一项极有意义的课题。

南瓜为葫芦科南瓜属植物南瓜(CucurbitamoschataDuch.)的果实，其营养成分丰富、全面而独特[6]。从南瓜中提取的南瓜黄色素作为一种天然色素，色泽自然、兼有营养或药理作用，受到人们广泛关注[7]。目前，有关南瓜黄色素提取、纯化的研究不少[8,9]，但对南瓜黄色素营养功能的研究较少[10]，特别是关于南瓜黄色素清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成以及抑菌活性的研究未见报道。因此，本文研究南瓜黄色素清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成及其抑菌活性，以期为人们科学认识南瓜黄色素的营养保健功能，合理使用、深度开发利用南瓜黄色素提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器

723型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；WD-9403A型紫外仪(北京市六一仪器厂)；Scientz-10N型冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2 试剂与材料

无水乙醇、亚硝酸钠、1-萘胺、柠檬酸、无水碳酸钠、N-1-萘基乙二胺盐酸盐和磷酸氢二钠等均为国产分析纯；质量分数33%的二甲胺、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)为化学纯；蛋白胨、牛肉膏和琼脂粉为生物试剂。实验用水为二去离子水。

供试菌种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌由本校生物系实验室提供。

南瓜购于当地农贸市场，洗净、晾干、去皮和瓤，切成5mm左右的薄片，在烘箱中烘干后，粉碎，过40目筛，制得南瓜粉，装瓶备用。

1.3 实验方法

1.3.1南瓜黄色素的提取参考文献方法[11]略作改进。称取南瓜粉50 g，以95%乙醇为提取溶剂，在料液比(g∶mL)1∶15，超声功率280 W，温度60 ℃的条件下，提取40 min。提取液过滤，旋转蒸发除去溶剂后冷冻真空干燥，得南瓜黄色素，产品得率为8.09%。

1.3.2南瓜黄色素与BHT对亚硝胺合成的阻断率采用紫外光解法[12]测定。 实验时参照文献方法[2]略作改进。精确吸取质量浓度为2.34 mg/mL的南瓜黄色素溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL，置于10支25 mL比色管中，均依次加入10 mL pH约为3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，1.0 mL 1.0 mmol/L的NaNO2溶液和1.0 mL 1.0 mmol/L二甲胺溶液，去离子水定容至刻度，在水浴锅中37 ℃恒温反应1 h。准确吸取此含有亚硝胺的反应液1.0 mL于10 mL比色管中，加入0.5 mL的质量分数为0.5%的Na2CO3溶液，用紫外灯照射15 min，取出后加1.5 mL质量分数1%的对氨基苯磺酸溶液，1.5 mL质量分数0.1%的1-萘胺溶液，以及0.5 mL去离子水，摇匀，静置15 min后，在波长525 nm处测其吸光度值，计算阻断率(%)。

阻断率(%)=[(A0-A)/A0]×100

(1)

式中：A0为未加南瓜黄色素时体系吸光度；A为加入南瓜黄色素后体系吸光度。

为了比较南瓜黄色素对亚硝胺合成的阻断能力，以上述方法测定不同体积质量浓度为0.2 mg/mL的常用抗氧化剂BHT对亚硝胺合成的阻断率。

1.3.3南瓜黄色素与BHT对亚硝酸钠的清除率参考文献方法[2,13]，采用盐酸萘乙二胺法测定。在10支25 mL比色管中分别加入2.0 mL 5.0g/mL的NaNO2标准溶液，加入10 mL pH约为3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，再分别加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黄色素溶液，在37 ℃恒温反应20 min，然后各加入2.0 mL质量分数为0.4%的对氨基苯磺酸，摇匀，静置5 min，再各加入1.0 mL质量分数0.2%盐酸萘乙二胺，用去离子水稀释至刻度，摇匀，静置反应15 min后，在最大吸收波长540 nm处测定吸光度，并计算南瓜黄色素对亚硝酸钠的清除率(%)：

清除率(%)=[(A0-A)/A0]×100

(2)

式中：A0为未加南瓜黄色素时体系吸光度；A为加入南瓜黄色素后体系吸光度。

为了比较南瓜黄色素对亚硝酸钠的清除能力，以上述方法，测定不同体积质量浓度为0.2 mg/mL的常用抗氧化剂BHT对亚硝酸钠的清除率。

1.3.4南瓜黄色素抑菌活性参考文献采用滤纸片法[14]测定。将牛肉膏蛋白胨培养基制成带菌平皿，浸有南瓜黄色素溶液的直径5 mm滤纸片分别贴于含菌平皿的外围，浸有无菌水的滤纸片贴于中央，以做阴性对照。然后将平皿倒置于恒温培养箱中，37 ℃培养24 h。每种浓度滤纸片做3次重复，观察结果并用游标卡尺测量抑菌圈直径取平均值。阴性对照组抑菌圈直径应小于或等于5.0 mm，否则实验无效。

1.4 数据处理

实验均做三次重复，数据取平均值，数据分析采用Excel.2007进行。

2 结果与讨论

2.1 南瓜黄色素与BHT对亚硝胺合成的阻断率

实验结果如图1。由图1可知，在模拟人体胃液条件(pH=3.0，温度37 ℃)下，南瓜黄色素对亚硝胺合成具有一定的阻断能力，阻断率随其用量的增加而增大。4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黄色素溶液对亚硝胺合成阻断率可达93.58%。但其阻断率明显弱于BHT，计算得南瓜黄色素、BHT对亚硝胺合成阻断率的Ec50分别为1.14、0.09 mg/mL。

2.2 南瓜黄色素与BHT对亚硝酸钠的清除率

由图2可知，在模拟人体胃液条件下，南瓜黄色素与BHT对亚硝酸钠的清除率，随其用量的增加而增高，4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黄色素溶液对亚硝酸钠的清除率可达71.56 %。表明南瓜黄色素具有一定亚硝酸钠清除能力。对亚硝酸钠的清除率南瓜黄色素明显弱于BHT，南瓜黄色素、BHT对亚硝酸钠清除率的Ec50分别为1.47、0.13 mg/mL。

2.3 南瓜黄色素的抑菌活性

由表1可知，随南瓜黄色素质量浓度增大抑菌圈直径增大，表明抑菌能力与南瓜黄色素质量浓度正相关。南瓜黄色素对三种供试菌均有一定的抑制作用，对大肠杆菌的抑制作用最强，对枯草芽孢杆菌的抑制作用相对最弱。同时可以发现，供试菌中既有杆菌，又有球菌；既有革兰氏阳性菌，又有革兰氏阴性菌，这表明南瓜黄色素具有广谱抑菌活性。

表1 南瓜黄色素的抑菌活性

Note:Table shows the antibacterial circle diameter(including the filter diameter),"-" antibacterial；"+" no antibacterial.

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌是食品加工和贮藏中常见的腐败细菌，本实验证明南瓜黄色素对它们均有一定的抑制作用，表明南瓜黄色素具有作为食品防腐剂的应用前景。有关南瓜黄色素的抑菌机制尚不很明确，一般认为可能是南瓜黄色素中一些活性物质能特异性地凝固细菌蛋白，从而改变了细菌生理功能抑制了细菌的生长；或者是南瓜黄色素与细菌生长所需的物质结合，使细菌由于缺乏生长所需的物质受到抑制而死亡[14]。具体作用机制还有待进一步深入研究。

3 结论

在模拟人体胃液条件(pH=3.0,温度37 ℃)下，南瓜黄色素对亚硝胺合成的阻断率和对亚硝酸钠的清除率，随其浓度的增加而增加，对亚硝胺合成的阻断率最大可达93.58%，对亚硝酸钠的清除率可达71.56 %。表明南瓜黄色素具有一定的阻断亚硝胺合成能力和清除亚硝酸盐能力，但其阻断亚硝胺合成能力和清除亚硝酸盐能力明显弱于常用抗氧化剂BHT。同时抑菌实验表明，南瓜黄色素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有一定的抑菌活性，且其对三种供试菌种抑制能力大小顺序为：大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌。南瓜黄色素具有广谱抑菌活性。

南瓜黄色素不仅是一种天然食用色素，可用于食品添加剂，本实验还证明南瓜黄色素具有防腐作用和防癌抗癌营养保健功能，南瓜黄色素极有可能是一种防癌抗癌保健品和绿色天然防腐剂的新资源，开发前景可观。值得进一步深入研究。