沙棘种子形成发育过程中油脂合成积累关键基因的表达分析

丁 健，阮成江，单金友，关 莹

(1 大连民族大学 资源植物研究所，辽宁大连 116600；2 黑龙江省农业科学院 浆果研究所，黑龙江绥棱 152200)



沙棘种子形成发育过程中油脂合成积累关键基因的表达分析

丁 健1，2，阮成江1*，单金友2，关 莹2

(1 大连民族大学 资源植物研究所，辽宁大连 116600；2 黑龙江省农业科学院 浆果研究所，黑龙江绥棱 152200)

为探讨沙棘种子油脂积累与相关基因表达的关系，以不同发育期间(6月25日、7月6日、7月17日、7月28日、8月8日和8月19日)的近缘高油品系‘新俄3号’和低油品系‘绥棘1号’种子为试材，利用氯仿甲醇法测定含油率，采用实时荧光定量PCR方法分析限速酶基因的表达模式，验证各基因在天然高低油种子间的表达差异。结果表明：(1)除7月17日外，其他时期‘新俄3号’的种子含油率均高于‘绥棘1号’；7月6日～7月28日期间油脂迅速积累，而且‘新俄3号’种子含油率增速大于‘绥棘1号’。(2)油脂迅速积累期的GPD1基因高表达，可能通过促进3-磷酸甘油合成进而加速‘新俄3号’种子油脂高积累；油脂积累过程中DGAT1和DGAT2基因在‘新俄3号’种子中的表达量一直高于‘绥棘1号’。研究认为，GPD1、DGAT1和DGAT2基因可能与‘新俄3号’种子油脂的相对高积累有关。本研究结果为进一步深入验证沙棘油脂合成限速酶基因功能奠定基础。

沙棘；含油率；油脂合成；基因表达

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属多年生灌木或小乔木，其果实油脂中高积累的omega-3、omega-6和omega-7脂肪酸，在预防和治疗癌症、冠心病和胃肠疾病等方面具有显著疗效[1]。但较低的含油率(种子为7%～11%，鲜果肉为1%～5%)制约了沙棘油的高效开发和利用[2-3]，目前关于沙棘种子油脂合成积累机制的研究较少，其中的关键基因及代谢途径尚未清晰[4]。

沙棘油脂的主要成分是甘油三酯(triacylglycerols，TAG)，其含量与种子含油率密切相关[2,5]。TAG以3-磷酸甘油(glycerol-3-phosphate，G3P)为骨架，在内质网上连续组装来自于细胞溶质的acyl-CoA脂肪酸而成[6]，而G3P是由糖酵解的中间产物磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)被3-磷酸甘油脱氢酶还原而来[7]，GPD1(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)是3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因，它在碳水化合物和脂类代谢中起关键作用[8]，是脂类合成的限速酶[9]。Vigeolas等[7,10]研究发现注射甘油到油菜(BrassicanapusL)种子中可提高G3P和TAG含量，随后，在油菜中异位表达酵母GPD1基因，发现其表达量增加2倍可使G3P水平增加3～4倍，种子含油率提高40%，而且G3P含量与种子油脂积累存在协同关系。因此，GPD1基因可能是影响沙棘种子含油率的重要基因。以G3P为初始底物的Kennedy途径是植物种子TAG合成的主要途径，即G3P经3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)和溶血磷脂酸酰基转移酶(lyso-phosphatidic acid acyltransferase，LPAAT)酰基化生成磷酯酸(phosphatidic acid，PA)，然后PA经磷酸水解酶(phosphohydrolase)脱磷酸化为二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，最后经二酰甘油转移酶(diacylglycerol acyltransferases，DGAT)酰化为TAG[11]。DGAT是影响脂类积累的限速酶[12-13]，在许多植物体中编码2类非同源的DGAT基因(DGAT1和DGAT2)[14-15]。有研究发现DGAT1基因突变体可限制野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)的TAG合成，而过量表达DGAT1基因可增加种子含油率11%～28%[13]。而DGAT2基因在TAG合成过程中具有使DAG特异结合某些特殊脂肪酸的作用，如油桐(Verniciafordii)中的桐油酸(eleostearic acid)，其为一种十八碳三烯酸[16]。Chen等[17]将油桐的VfDGAT2基因导入红酵母(Rhodotorulaglutinis)和拟南芥中，发现VfDGAT2基因表达量与总脂肪酸含量线性相关。因此，DGAT1和DGAT2基因也可能与沙棘种子油脂形成有密切关系。

本研究以高油品系‘新俄3号’和低油品系‘绥棘1号’种子为试材，分析不同时期的种子含油率，并研究GPD1、DGAT1和DGAT2基因表达模式及其在高低油种子中的表达差异，揭示高低油种子的油脂积累与相关限速酶基因的关系，这可为深入验证沙棘油脂合成限速酶基因功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

以2个蒙古沙棘亚种‘新俄3号’(‘Xin’e 3’)和‘绥棘1号’(‘Suiji 1’)为试验材料，二者间基于ISSR标记分析的遗传相似系数为0.756[18]，果实分别于2015年6月25日、7月6日、7月17日、7月28日、8月8日和8月19日采自黑龙江省农业科学院浆果研究所。各品系样品采自3株无性繁殖植株的多个部位，同植株果实混合，用锡纸包裹后置于液氮中速冻。样品运抵大连民族大学资源植物研究所，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 方 法

1.2.1 种子含油率测定 采用氯仿甲醇法[2,19-20]测定不同时期沙棘种子含油率：冷冻干燥的种子粉末转移至玻璃试管中，加入甲醇和氯仿(均为色谱纯，Honeywell公司)漩涡混匀后超声30 min，上清液转移到新试管中，残渣用氯仿甲醇(体积浓度百分比2∶1)再次提取，合并的上清液加入其1/4体积的氯化钾溶液(质量浓度0.88%)，收集下层液至玻璃样品瓶中，挥发至恒重。含油率(%)=(m1-m2)/m×100；m1为油脂和玻璃样品瓶的质量(g)；m2为玻璃样品瓶的质量(g)；m为干燥样品粉末的质量(g)，3次重复。

表1 荧光定量RT-PCR引物

1.2.2 荧光定量RT-PCR检测 参照柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(上海生物工程公司)方法提取沙棘种子总RNA，根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(大连宝生物公司)方法合成第一链cDNA[21]。

本研究前期构建了沙棘种子、果肉、叶、茎和根转录组，获得了大量的功能基因注释以及差异表达基因信息。利用筛选获得的目的基因片段和PrimerQuest在线软件设计特异引物(表1)。参照SYBR Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒(大连宝生物公司)方法和ABI7500 Real time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)推荐程序进行qRT-PCR[11]，以沙棘UBQ5为内参基因[4]，采用2-ΔΔCt方法分析目的基因相对表达量[22]。实验3次重复。

1.2.3 数据统计分析 利用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和LSD法进行差异性检验，采用Excel2010进行作图。

2 结果与分析

2.1 沙棘种子形成发育过程中含油率的动态变化

与6月25日相比，7月6日后种子明显增大(图1)，8月8日后种子体积减小，6月25日～8月8

日期间种子和果实颜色变化明显。除7月17日外，其他5个时期的‘新俄3号’种子含油率均高于‘绥棘1号’(图2)。6月25日～7月6日期间含油率的下降，可能与‘绥棘1号’和‘新俄3号’种子未发育完全及多糖和蛋白质的积累有关[23]。7月6日～7月17日为‘绥棘1号’的油脂迅速积累期，‘新俄3号’为7月17日～7月28日，且‘绥棘1号’更早进入油脂积累稳定期。7月28日后‘新俄3号’的种子含油率是‘绥棘1号’的1.2～1.3倍(图2)。

不同的小写字母表示同一采收期2个品种间含油率在0.05水平上的显著差异图2 ‘新俄3号’和‘绥棘1号’种子形成和发育过程中含油率变化Different normal letters indicate significant differences of oil content between two lines at the same harvest time at the level of 0.05Fig. 2 Changes of oil contents in the seeds of lines ‘Suiji 1’ and ‘Xin’e 3’ during seed formation and development

图1 品系‘新俄3号’和‘绥棘1号’果实和种子形态和颜色变化Fig. 1 Shape and color of fruits and seeds of lines ‘Suiji 1’ and ‘Xin’e 3’

*表示同一采收期2个品种间的基因相对表达量在0.05水平上的显著差异图3 GPD1、DGAT1和DGAT2基因在‘新俄3号’和‘绥棘1号’种子中的表达差异* indicates significant differences of gene relative expression level between the two lines on the same harvest time at the level of 0.05Fig. 3 Differences of GPD1, DGAT1 and DGAT2 genes expression in seeds between the line ‘Suiji 1’ and ‘Xin’e 3’

2.2 GPD1、DGAT1和DGAT2基因表达分析

‘新俄3号’和‘绥棘1号’的GPD1基因表达量在7月17日达峰值(图3，A)，且‘新俄3号’的峰值显著高于‘绥棘1号’(约1.6倍)。GPD1基因催化合成G3P，油菜的G3P含量达峰值后的第5～15天，其种子油脂含量才开始迅速上升至峰值[10]。‘新俄3号’的种子含油率在7月28日达峰值(图2)，滞后于GPD1表达量峰值11 d。

7月6日后‘新俄3号’和‘绥棘1号’开始形成完整的种子结构，‘新俄3号’的DGAT1和DGAT2基因表达量一直高于‘绥棘1号’(图3，B、C)；而且在7月28日～8月19日期间达显著差异水平，与这一期间的‘新俄3号’种子含油率显著高于‘绥棘1号’相一致。尤其，‘新俄3号’的种子含油率(图2)和DGAT2基因表达量均在7月28日达峰值(图3，C)。

3 讨 论

沙棘种子油脂中亚油酸和亚麻酸比值符合健康食用油的国际标准(1∶1～4∶1)[2,24]，但较低的产量限制了沙棘油的开发利用。本研究考察了不同时期沙棘高低油种子的含油率，其变化趋势与麻疯树、油菜和芝麻相似[25-27]。沙棘在4月末～5月初授粉后以营养生长为主，且种子结构不完整，需要脂类参与其结构发育[28]，这可能与发育初期含油率下降有关。6月25日～7月28日期间，相对较高GPD1基因表达量，为TAG的合成积累更多初始底物G3P[7]，进而提升种子含油率。在Vigeolas等[10]向油菜种子注射外源甘油的实验中，G3P含量并未迅速上升，而且油脂含量高峰滞后于G3P高峰15 d。本研究中含油率的变化也滞后于GPD1基因表达量的变化，6月25日～7月6日期间‘绥棘1号’的GPD1基因表达量高于‘新俄3号’，可能促进‘绥棘1号’积累了更多G3P，使7月17日的含油率高于‘新俄3号’；随后‘新俄3号’的GPD1基因表达量超过‘绥棘1号’且达峰值(7月17日)，促使‘新俄3号’的含油率在7月28日达峰值且显著高于‘绥棘1号’，而且在油脂积累稳定期两个品系的种子含油率相差1.2～1.3倍，与GPD1基因表达量峰值相差倍数相近(1.6倍)。因此，推测GPD1基因可促进沙棘种子油脂合成。近年来，在麻疯树(JatrophacurcasL.)和印加果(PlukenetiavolubilisL.)种子中也发现GPD基因表达量与TAG含量变化相关[21,25]。

‘新俄3号’的GPD1和DGAT2基因在油脂迅速积累期间均呈现出明显的表达量高峰，且显著高于‘绥棘1号’，表明GPD1和DGAT2基因在种子发育期间的高表达可能促进油脂高积累。发育期的印加果GPD1和DGAT2基因表达量也呈明显的单峰曲线变化规律，且与油脂合成相关[21]。DGAT1和DGAT2基因具有促进脂肪酸参与TAG组装的作用[11]。‘新俄3号’种子的DGAT1和DGAT2基因表达量在7月6日～8月19日期间均高于‘绥棘1号’，可催化更多DAG转化为TAG，进而使种子含油率高于‘绥棘1号’。发育期文冠果胚的油脂积累与XsDGAT1和XsDGAT2基因表达模式相关，与非转基因植株相比，异源表达文冠果XsDGAT1和XsDGAT2基因的拟南芥种子油脂含量分别提高71.6(20.3%)和30.9 μg/mg(8.8%)[11]。不同物种和组织对DGAT1和DGAT2基因的响应程度存在一定差异，而它们对沙棘种子含油率的影响程度还需要进一步验证。‘绥棘1号’和‘新俄3号’有相近的遗传关系，均为中国自主选育的蒙古沙棘亚种实生子代，‘绥棘1号’在黑龙江选育，而‘新俄3号’选育自辽宁，父本的差异也可能是导致‘绥棘1号’种子含油率低于‘新俄3号’的原因。有研究表明沙棘种子油脂含量受父本基因型影响，而父本基因型通过改变C18脂肪酸(尤其亚麻酸)比例来影响TAG[29]，亚麻酸(十八碳三烯酸)是沙棘种子中的主要脂肪酸[2]。Li等[16]发现油桐中有催化桐油酸(十八碳三烯酸)与TAG特异结合的DGAT2基因。吴永美等[30]将猫爪草(Doxanthaunguis-cati)的Δ9D(delta-9 desaturase)基因(催化棕榈酸去饱和为棕榈油酸)和对棕榈油酸有特异选择性的DGAT酶基因在大豆中共表达发现，大豆体细胞胚的棕榈油酸含量上升到19%，比单独转化Δ9D基因高7%。因此在后续研究中获得对亚麻酸有特异选择性的DGAT基因对进一步解析沙棘种子油脂合成积累机理具有重要意义。

阮成江等[31]研究表明TAG的生物合成与“源基因”和“汇基因”相关，同时调控GPD1关键限速酶基因(源基因)和DGAT关键酶基因(汇基因)可提高植物种子含油量，二者的相互作用机制对提高油脂产量和品质具有重要作用。随后有学者将脂肪酸的生物合成形容为“推”，将脂肪酸组装合成TAG形容为“拉”，在烟草中瞬时共表达拟南芥的WRI1和DGAT1基因可产生协同作用，转基因烟草的干叶TAG含量可提高约100倍(2.48%)，是转化单一基因的5倍左右[32]。Chen等[17]将油桐的VfFAD2和VfDGAT2基因融合导入红酵母和拟南芥中，发现它们具有协同促进不饱和脂肪酸积累的作用，且可获得更高含量的C18:3(红酵母中提高174%，拟南芥中提高14.6%)。沙棘种子油脂生物合成途径复杂，同时涉及到果肉油脂的合成，这些结构基因和调节基因对沙棘种子油脂积累的影响正在进一步的研究验证之中。

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(编辑:宋亚珍)

Expression of Key Genes Involved in Lipid Biosynthesis and Accumulation during Seeds Formation and Development inHippophaerhamnoides

DING Jian1,2, RUAN Chengjiang1*, SHAN Jinyou2, GUAN Ying2

(1 Institute of Plant Resources, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116600, China; 2 Institute of Berries, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Suiling, Heilongjiang 152200, China)

To explore the relationship between lipid biosynthesis and relevant gene expression in sea buckthorn seeds, we harvested the developing seeds of the line ‘Xin’e 3’ with high oil content and the line ‘Suiji 1’ with low oil content as experimental materials on June 25, July 6, 17, 28, August 8 and 19. These two lines had closed genetic relationship. The oil content in seeds was determined by the method of chloroform methanol, and the expression profiles ofGPD1,DGAT1 andDGAT2 genes involved in lipid biosynthesis were tested using real-time quantitative PCR. The results showed that: (1) the oil content in the seeds of ‘Xin’e 3’ was higher than that in ‘Suiji 1’ except for July 17. The rapid accumulations of seed lipid of these two lines were during July 6 to 28, and the increasing rates in ‘Xin’e 3’ were higher than that in ‘Suiji 1’; (2) the high expression ofGPD1 gene occurred in the period of rapid lipid accumulation, which may speed up lipid biosynthesis in ‘Xin’e 3’ seeds through promoting the biosynthesis of glycerol-3-phosphate. The expression levels ofDGAT1 andDGAT2 genes in line ‘Xin’e 3’ were higher than that in line ‘Suiji 1’ during lipid accumulation. Thus,GPD1,DGAT1 andDGAT2 genes may be associated with the high accumulation of lipid in ‘Xin’e 3’ seeds. These results provided scientific bases for validating the function of genes encoding for rate-limiting enzymes involved in sea buckthorn lipid biosynthesis and accumulation.

Hippophaerhamnoides; oil content; lipid biosynthesis; gene expression

1000-4025(2016)08-1642-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1642

2016-05-16;修改稿收到日期:2016-07-12

国家自然科学基金(31570681)

丁 健(1983-)，男，在读博士研究生，助理研究员，主要从事资源植物开发利用与遗传育种研究。E-mail: mervyntin2901@aliyun.com

*通信作者:阮成江，教授，主要从事木本油料种质创新与开发利用研究。E-mail: ruan@dlnu.edu.cn

Q945.4；Q786

A