解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2与疏水蛋白SC3融合表达及催化性质

邱玉龙，邓冬梅，潘淑兰，孙宇飞

(广西科技大学 生物与化学工程学院，广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州，545006)



解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2与疏水蛋白SC3融合表达及催化性质

邱玉龙，邓冬梅，潘淑兰，孙宇飞*

(广西科技大学 生物与化学工程学院，广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州，545006)

为研究疏水蛋白融合表达对脂肪酶的催化性质影响，分别构建分泌表达解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2，带His标签Lip2及Lip2与疏水蛋白SC3融合蛋白的重组质粒PKL、PKHL和PKHLS并分别转化到毕赤酵母 GS115 菌株中，通过筛选，获得表达活性较高的工程菌株(KL、KHL、KHLS)。对3株重组菌株的培养与重组蛋白催化性质研究表明蛋白相对分子质量为36 kDa、36 kDa、46 kDa，发酵液对底物对硝基苯酚辛酸酯(p-NPC) 水解酶活分别达到 5.35、4.69、2.4 U/mL。最适温度均是45 ℃，最适pH均是7.5，另外KHLS菌株的酶活力受表面活性剂的影响比KL和KHL小。

解脂耶氏酵母脂肪酶；裂褶菌疏水蛋白SC3；毕赤酵母；表面活性剂；催化性质

脂肪酶(Triacylglycerol acylhydrolase，EC 3.1.1.3)是一类能够催化天然油脂底物水解，产生脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油的水解酶[1]。作为一种重要的工业用酶，脂肪酶在食品工业、油脂工业[2]、饲料工业[3]、医药工业、洗涤工业及生物能源等行业具有广泛的应用[4]。解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是一种可以分泌多种代谢产物的非常规酵母[5]，其脂肪酶 Lip2 是一种优良的脂肪酶，具备很高的酯化、水解、转酯活性，已被应用到对映体拆分、酯合成、生物柴油合成等领域[6-9]，真菌疏水蛋白(Fungal hydrophobin)是子囊菌和担子菌等高等真菌细胞表面的一类小分子量蛋白。疏水蛋白与其它蛋白质相比具有一些独特性质如亲水-疏水两面性，当疏水蛋白单体遇到亲水-疏水界面时会自发组装有序排列形成一层性质稳定的厚约10 nm的两亲性(amphipathic)蛋白薄膜，使疏水蛋白具有自组装的性质。疏水蛋白的独特性质使其在食品、医药、化妆品、工业催化[10-12]等方面具有广阔的应用前景。

毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种被广泛用作异源表达重组蛋白的酵母。和细菌一样，毕赤酵母也是一种单细胞微生物，它们生长速度快，培养成本低。 然而和细菌不同的是，酵母是真核生物，有着复杂的翻译后修饰体系，因此，毕赤酵母很适合表达真核生物的蛋白。解耶氏酵母与毕赤酵母之间的亲缘关系很近，它们有着相同或相似的蛋白质表达后修饰体系。将解耶氏酵母的脂肪酶 Lip2 基因在毕赤酵母 GS115 菌株中表达是一种获得高活力脂肪酶 Lip2 的切实可行的策略。目前，已有研究报道了在毕赤酵母体系高效表达Lip2 脂肪酶的前例[13-15]。本研究将解脂耶氏酵母脂肪酶 Lip2基因与疏水蛋白基因连接在毕赤酵母中融合表达，探索疏水蛋白对Lip的表达及催化性质的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与质粒

毕赤酵母PichiapastorisGS115 菌株，购自美国Invitrogen公司，大肠杆菌EscherichiacoliTop10 F`为本实验室保存。pPIC9K购自美国Invitrogen公司,经过本实验室改造在其上面添加了MluI酶切位点。根据NCBI数据库中解脂耶氏酵母脂肪酶 Lip2基因和裂褶菌Schizophyllumcommune疏水蛋白SC3外显子拼接序列，设计其毕赤酵母密码子偏好的DNA序列，分别委托南京金瑞思生物科技有限公司进行全基因合成。合成的基因克隆在质粒pUL中。

1.1.2试剂及仪器

限制性内切酶EcoRI、ApaI、SalI、MluI、Taq酶和T4DNA 连接酶等购自加拿大Fermentas公司。DNA 凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，其他试剂均为国产分析纯。GenePulser Xcell 电击转化仪,Bio-Rad 公司；PCR 仪，德国Biometra 公司；紫外显影仪北京市六一仪器厂；DNA电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。

1.1.3培养基

培养基 YPD、MD、BMGY 和 BMMY 等参照 Invitrogen 公司的毕赤酵母表达手册配制。

1.1.4引物

用于扩增去自身信号肽Lip2基因的引物对为：MatL1(5’-CGCGACGCGTGTTTATACTTCCACAGAG-3’)和MatL2(5’- CGCGGAATTCTTAAATACCGCAAACTCCCTC-3’)，其中下划线部分为引入的限制性内切酶MluI和EcoRI 的酶切位点。用于扩增去自身的信号肽且N端带 6*His 标签的 Lip2基因的引物对为：MatL3(5’-CGCGACGCGTCACCACCACCACCACCACGTTTATACTTCCACAGAG-3’)和MatL4(5’-CGCGGGGCCCAATACCGCAAACTCCCTC-3’)其中斜体为 6*His标签编码序列，下划线部分为引入的限制性内切酶MluI和ApaI 的酶切位点。用于扩增SC3基因的引物对为：MatL5(5’-CGCGGGGCCCTTGCCAGGTGGTCACC-3’)和MatL6(5’-CGCGGAATTCCAAGATGTTGATTGGAGTA-3’)其中下划线部分为引入的限制性内切酶ApaI和EcoRI 的酶切位点。

1.2实验方法

1.2.1酵母表达载体 PL、PHL和PHLS 的构建

以提取的质粒pUL为模板，用引物MatL1/MatL2进行PCR，扩增PCR 产物和载体 pPIC9K 分别用MluI和EcoRI 酶切, 经凝胶回收试剂盒纯化后用 T4DNA 连接酶连接，获得连接好的pPIC9K-Lip2(以下简称PKL)载体。以提取的质粒pUL为模板，引物MatL3/MatL4进行PCR，扩增PCR 产物和载体 pPIC9K 分别用MluI和ApaI酶切, 经凝胶回收试剂盒纯化后用 T4DNA 连接酶连接，获得连接好的PHL载体。将上面两种连接产物转化至大肠杆菌Top10中，经含氨苄青霉素的 LB 平板的筛选,挑取单菌落抽提质粒，经 PCR 和酶切进行鉴定后，将阳性克隆送至上海立菲生物技术有限公司测序, 以确定其阅读框的正确性。获得载体 PL、PHL。以提取的质粒pUL为模板，用引物MatL5/MatL6进行PCR，扩增PCR 产物和载体 pPIC9K-6*His-Lip2(以下简称PKHL)分别用ApaI和EcoRI 酶切，经凝胶回收试剂盒纯化后用 T4DNA 连接酶连接，获得连接好的PHLS载体。将连接产物转化至大肠杆菌Top10中，经含氨苄青霉素的 LB 平板的筛选,挑取单菌落抽提质粒， 经 PCR 和酶切进行鉴定后，将阳性克隆送至上海立菲生物技术有限公司测序，保证其阅读框的正确性。获得载体pPIC9K-6*His-Lip2-SC3(以下简称PKHLS)。

1.2.2酵母转化及筛选

将表达载体PKL、PKHL和PKHLS用限制性内切酶SalI线性化后,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，电击转化后，将细胞涂布在MD平板上，28 ℃培养2.5 d。长出菌落后将菌落转移到乳化Tributyrin固体平板上，28 ℃培养2～3 d。挑取有明显水解圈并且水解圈比较大的克隆子进行 PCR验证和酶活力筛选，获得的重组酵母菌体分别命名为KL、KHL和KHLS。

1.2.3脂肪酶酶活的定量测定

脂肪酶活性测定采用调整后的硝基苯酚法[16]：菌株经过发酵后发酵液用于酶活测定。将20.9 mg 对硝基苯酚辛酸酯(p-NPC) 溶解于10 mL乙腈中，形成 10 mmol/L的p-NPC 溶液。向试管中加入2.8 mL Tris-HCl 缓冲液(pH 7.5)、50 μL 10 mmol/Lp-NPC 溶液和150 μL 无水乙醇，混匀，形成3mL底物溶液。试放管置于45℃ 水浴锅中预热 5 min。向试管中加入 50 μL 菌悬液，在 45 ℃ 下反应10 min，加入10 μL 0.5 mol/L 的EDTA， 利用分光光度计测 OD410值。脂肪酶每分钟水解p-NPC产生 1 μmol的对硝基苯酚(pNP)所需的酶量定义为1个活力单位(U)。

1.3脂肪酶酶学性质研究

1.3.1最适温度及最适 pH

通过对不同菌种测定不同温度(30、35、40、45 、50、50 ℃)下的p-NPC水解酶活以确定各个脂肪酶的最适温度。通过测定不同的 pH(6.5～9.5)下对p-NPC酶活力，以确定各个脂肪酶的最适pH。每个温度和pH测定3次取平均值。

1.3.2底物特异性

在 pH7.5、45 ℃条件下测定不同菌种发酵液对不同的底物水解特异性。底物分别为：4-硝基苯基丁酸酯(C4)、对硝基苯酚辛酸酯(C8)、对硝基苯酚月桂酸酯(C12)、对硝基苯酚棕榈酸酯(C16)。

1.3.3表面活性剂对酶活力的影响

将发酵液中分别加入不同表面活性剂(SDS、Tween 20、Tween 80、Triton X-100)，使其质量分数为1%。在4 ℃冰箱保存1 h。之后，取样测定其在 pH7.5、45 ℃条件下对p-NPC 的水解活力。另外分别取空白酵母GS115与3种重组酵母发酵液10 mL于样品瓶中，用力摇匀样品瓶，使4组发酵液泡沫丰富程度基本保持一致，静置12 h后观察4组发酵液泡沫维持情况。

2　结果与讨论

2.1酵母表达载体 PKL、PKHL和PKHLS 的构建

将连接好的载体PKL、PKHL和PKHLS(图1和图2)转入大肠杆菌TOP10中，挑单菌落提质粒，用对应的引物进行PCR验证。结果均符合预期，脂肪酶Lip2的目的片段大小为950 bp，SC3疏水蛋白目的基因片段大小为350 bp。测序检测结果显示并无突变。

图1　质粒图谱Fig.1　Plasmids construction map

M-Marker；1-PKL plasmid；2-PKHL plasmid；3-Lip2 fragment in PKHLS plasmid；4-SC3 fragment in PKHLS plasmid；5-Blank control图2　转化菌体提质粒PCR验证Fig.2　Transforming bacterial plasmid PCR validation mention

2.2酵母的转化与筛选

在三丁酸甘油酯平板上可以观察到 KL、KHL和KHLS重组子周围有水解透明圈，而对照则无明显水解圈，说明表面展示的 Lip2 具备水解三丁酸甘油脂的能力(图3)。对重组菌株发酵液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图4所示。KL、KHL重组子在 36.0 kDa 附近各有一条带，这一条带与解耶氏酵母脂肪酶 Lip2 大小一致。KHLS 重组子在46 kDa 附近有一条带，这一条带与解耶氏酵母脂肪酶 Lip2 与疏水蛋白SC3加和大小基本相符。另外由SDS-PAGE电泳图谱可知，KHLS的表达量远远低于KL、KHL两种菌株。原因可能是疏水蛋白与毕赤酵母自身蛋白的性质差异太大，在肽链翻译及修饰过程中被白内蛋白降解体系识别为非正常肽链而大部分降解了，以毕赤酵母表达纯疏水蛋白时此现象更明显[10,17]。

图3　重组菌株三丁酸甘油酯平板筛选Fig.3　Lipase activity detection

图4　KL、KHL和KHLS 重组子摇瓶发酵表达脂肪酶的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of KL, KHL and KHLS recombinant shake flask for the expression of lipase

2.3最适温度及最适pH值

通过对不同菌种测定不同温度不同pH下的p-NPC水解酶活以确定各个脂肪酶的最适温度与最适pH。由图5可知，KL、KHL和KHLS表达的3种脂肪酶在低于 40 ℃ 时随着温度升高酶活快速上升，40～45 ℃时酶活缓慢上升，至45 ℃时酶活达到最大。高于 45 ℃之后KL和KHLS酶活缓慢下降，KHL酶则快速下降。由图6可知，在小于 pH 7.5 之前，KL、KHL和KHLS三种脂肪酶酶活随 pH 值增加迅速上升，而在 pH 7.5之后则随着 pH 值的增加而快速下降，因此三者的最适温度和最适pH值相同，均为45 ℃和pH 7.5。说明与SC3融合后Lip2的最适温度、最适pH等催化性质没有受到影响。由于酶的活力表现受表达体系[18]及酶活检测所用底物和反应体系差异影响，本研究表达的Lip2最适作用条件与YU等[19]在P.pastorisX-33菌株表达的Lip2最适条件(40 ℃，pH 8.0)以及KUMARI等[20]在E.coliHB101系统表达的Lip2最适条件(40 ℃，pH 7.0)相比都略有差异。

图5　重组酶最适温度Fig.5　Recombinase optimum temperature

图6　重组酶最适pHFig.6　Recombinase optimum pH

从总酶活力分析，KL和KHL总体酶活力基本相当， KHLS酶活力达到前两者的60%左右，由SDS-PAGE电泳结果可知KHLS的表达量远远低于KL、KHL两种菌株，说明Lip2与SC3融合表达量比Lip2及His-Lip2显著降低，但酶活力并未成比例减少，甚至可以预计在蛋白含量相当的情况下His-Lip2-SC3的酶活力要比Lip2及His-Lip2更高，此结果提示SC3对Lip2的催化活力有促进作用。

2.4底物特异性

分别用不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测了KL、KHL和KHLS三种脂肪酶的酶活，由图7可以看出，KL与KHLS脂肪酶对C8(对硝基苯酚丁酸酯)的酶活力最高分别达到5.35 U/mL和2.4 U/mL， 而KHL脂肪酶对C12(对硝基苯酚月桂酸酯)的酶活最高达到4.69 U/ml。总体而言，这3种脂肪酶对于中等长度碳链底物(C8-C12)具有较高的催化活力，与YU等[19-21]报道的游离态脂肪酶 Lip2 对中长链底物特异性强的情况基本一致。SC3融合后Lip2的底物特异性没有发生明显改变，说明融合的SC3并未显著影响Lip2的底物结合位点的构象。有研究将Lip2脂肪酶与Aga2，Cwp2等酿酒酵母胞壁蛋白融合构建表面展示Lip2酶[22-23]，结果都显示其对中等长度碳链底物(C8-C12)的底物特异性强，也提示与Lip2端部融合的蛋白质可能不易影响Lip2对底物的选择。

图7　重组酶底物特异性Fig.7　Recombinant enzyme substrate specificity

2.5表面活性剂对酶活力的影响

表面活性剂是脂肪酶催化应用的常用助剂，可以帮助油脂底物在水相中分散，扩大接触表面积，疏水蛋白的两亲性使其与Lip2酶蛋白融合后可改善分子的表面活性。由图8可知12 h后GS115与KL、KHL发酵液泡沫基本消失，而KHLS发酵液仍有一些泡沫存在，说明脂肪酶Lip2与SC3融合后蛋白质分子自身表面活性有所提高，使得水-空气两相界面的接触面积增大。融合酶的这个性质有助于反应体系中水相中的酶与油脂底物接触，从而更好地发挥催化活力。

图8　发酵液泡沫维持时间比较Fig.8　Comparison of fermentation broth foam maintaining time

然而表面活性剂对酶活性有一定影响，这里用HLB(Hydrophile-Lipophile Balance Number)值不同的4种表面活性剂对酶进行处理。一般用HLB值来表示表面活性剂的极性。表面活性剂极性越强，HLB 值越大，亲水性越强[24]。 KL、KHL和KHLS三种酶经1%的非离子表面活性剂SDS(HLB-40)、Tween20(HLB-16.7)、Tween80(HLB-15.0)、TritonX-10(HLB-13.0)分别处理 1 h后酶活力如图9所示，3种酶的活力随着所加入的非离子表面活性剂(Tween20、Tween80、TritonX-100) HLB 值的降低而降低，说明非离子表面活性剂的亲水性越弱，越容易影响Lip2的酶活力。值得注意的是，3种酶经非离子表面活性剂处理后与未经处理的酶活力相比KL与KHL的酶活力急剧下降，而KHLS酶活力下降相对较小，说明在非离子表面活性剂存在的环境下SC3疏水蛋白有利于脂肪酶结构保持稳定并维持酶的催化活力。另外经阴离子表面活性剂SDS处理后的3种酶，酶活力降低均比较小，说明3种酶对SDS的耐受能力均比较强。一般认为离子型表面活性剂因其带电基团与酶分子间的强烈静电作用易使脂肪酶失活，而非离子型表面活性剂与酶分子间仅存在氢键和疏水作用，对酶的抑制性较弱[25-26]。然而酶和表面活性剂种类、结构差异，表面活性剂浓度差异等因素都会影响表面活性剂对酶的实际作用效果。有研究报导在反应体系中添加适当Tween-80有利于皱褶假丝酵母脂肪酶Lipase OF[25]及南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)[27]合成活力发挥，原因可能是表面活性剂有助于诱导脂肪酶“盖子”结构打开使活性中心暴露而提高催化效率，但高浓度表面活性剂也会占据脂质界面，抑制脂肪酶的吸附从而导致酶活下降[28]。本研究所用表面活性剂终浓度高达1%，因此普通Lip2酶分子受表面活性剂分子抑制使活性明显降低，而具有自身表面活性的KHLS产融合酶分子可参与脂质界面的争抢，表现出耐受高浓度表面活性剂的能力。

图9　不同表面活性剂对酶活力的影响Fig.9　Effect of different surfactants on the activity of the enzyme

为了赋予脂肪酶两亲性从而提高酶的表/界面活性，翁永珍在脂肪酶表面的氨基基团上共价连接长链硬脂酸[29]，所获修饰酶具有一定表面活性，其溶液表/界面张力提高，有机相中酯化活力和在油/水界面催化活性明显提高。KHLS的融合酶与此修饰酶有相似结构和表现，提示其可能也具有较佳的非水相催化能力。

3　结论

本研究首次将SC3疏水蛋白与脂肪酶Lip2在毕赤酵母中融合表达，融合酶相对分子大小为46 kDa，具有水解三丁酸甘油酯活力。经与Lip2酶比较，融合酶的最适pH为7.5，最适温度为45 ℃，最适底物为C8(对硝基苯酚辛酸酯)，与未融合脂肪酶 Lip2 基本一致。 Lip2酶活力受表面活性剂的影响较大，而融合酶酶活力受表面活性剂的影响较小，说明SC3对与其融合表达的脂肪酶的结构及酶活力具有一定的保护作用。

[1]ANGKAWIDJAJA C,KANAYA S.Family I.3 lipase: bacterial lipases secreted by the type I secretion system [J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2006,63(23):2 804-2 817.

[2]韦 伟,冯凤琴.sn-1,3 位专一性脂肪酶在食品中的应用[J].中国粮油学报,2012,27(2): 122-128.

[3]刘德海,解复红,贾彬,等.脂肪酶及其在饲料工业中的应用研究进展 [J].河南科学,2012, 30(7): 878-881.

[4]邓利,谭天伟,王芳.脂肪酶催化合成生物柴油的研究[J].生物工程学报,2003, 19(1): 97-101.

[5]NICAUD J M.Yarrowialipolytica[J]. Yeast, 2012,29(10):409-418.

[6]FICKERS P, BENETTI P H,WACHE Y,et al.Hydrophobic substrate utilisation by the yeastYarrowialipolytica, and its potential applications [J].Fems Yeast Research,2005,5(6/7): 527-543.

[7]DENG L,TAN T W,WANG F,et al.Enzymatic production of fatty acid alkyl esters with a lipase preparation fromCandidasp.[J].European Journal of Lipid Science and Technology,2003, 105(12): 727-734.

[8]GUIEYSSE D,SANDOVAL G,FAURE L,et al.New efficient lipase fromYarrowialipolyticafor the resolution of 2-bromo-arylacetic acid esters[J]. Tetrahedron:Asymmetry,2004,15(22): 3 539-3 543.

[9]HE X L,CHEN B Q,TAN T W.Enzymatic synthesis of 2-ethylhexyl esters of fatty acids by immobilized lipase fromCandidasp. 99-125[J].Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic, 2002,18(4/6):333-339.

[10]NIU B L,WANG D D,YANG Y Y,et al.Heterologous expression and characterization of the hydrophobin HFBI inPichiapastorisand evaluation of its contribution to the food industry[J].Amino Acids,2012,43(2):763-771.

[11]WANG Z L,YING S H,FENG M G,et al.Recognition of a core fragment ofBeauveriabassianahydrophobin gene promoter (Phyd1) and its special use in improving fungal biocontrol potential [J]. Microbial Biotechnology,2013,6(1):27-35.

[12]WANG Z,LIENEMANN M,QIAU M,et al.Mechanisms of protein adhesion on surface films of hydrophobin[J].Langmuir,2010,26(11):8 491-8 496.

[13]YU M,WEN S,TAN T.Enhancing production ofYarrowialipolyticalipase Lip2 inPichiapastoris[J].Engineering in Life Sciences,2010,10(5): 458-464.

[14]YU M,LANGE S,RICHTER S,et al.High-level expression of extracellular lipase Lip2 fromYarrowialipolyticainPichiapastorisand its purification and characterization[J].Protein Expression and Purification,2007,53(2):255-263.

[15]汪小锋,申旭光,赵鹤云,等.带 His-tag 的解脂耶氏酵母脂肪酶 Lip2 在毕赤酵母中的表达及纯化[J].中国生物工程杂志,2011,31(4):53-59.

[16]邱玉龙,邓冬梅,韦扬辉,等.壳聚糖微球固定化脂肪酶催化性质研究[J].广西科技大学学报, 2016,27(1):93-98.

[17]WANG Z F,FENG SR,HUANG Y J,et al.Expression and characterization of aGrifolafrondosahydrophobin inPichapastoris[J]. Protein Expression and Purification,2010,72: 19-25

[18]NARS G,SAUREL O,BORDES F,et al.Production of stable isotope labelled lipase Lip2 fromYarrowialipolyticafor NMR: investigation of several expression systems [J]. Protein Expression and Purification, 2014,101:14-20.

[19]YU M G,QIN S W,TAN T W.Purification and characterization of the extracellular lipase Lip2 fromYarrowialipolytica[J].Process Biochemistry,2007,42(3):384-391.

[20]KUMARI A,VERMA VV,GUPTA R.Comparative biochemical characterization and in silico analysis of novel lipases Lip11 and Lip12 with Lip2 fromYarrowialipolytica[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(11):3 103-3 111.

[21]张晓焰.解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的固定化工艺及其富集鱼油DHA的研究[D]. 武汉: 华中科技大学,2012:31-36.

[22]刘文山,徐莉,赵鹤云,等.利用a凝集素在酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2 [J]. 微生物学报,2008,48(11):1543-1548.

[23]刘文山, 赵鹤云,贾彬,等.解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的表面展示及其酶学性质[J].微生物学通报,2010,37(2):174-178.

[24]KUMAR S,KIKON K,UPADHYAY A.et al.Production, purifcation, and characterization of lipase from thermophilic and alkaliphilicBacilluscoagulansBTS-3 [J].Protein Expression and Purification,2005,41:38-44

[25]刘幽燕,许建和,胡英.表面活性剂对脂肪酶活性和选择性的影响[J].化学学报,2000,58(2): 149-152.

[26]周晓云,包广粮,钟卫鸿,等.脂肪酶在表面活性剂介质中的催化反应动力学研究[J].浙江工业大学学报, 2000,28(1):18-23.

[27]金子.毕赤酵母细胞展示的CALB脂肪酶的表征及非水相催化特性研究[D].广州:华南理工大学,2013:79-90.

[28]韩祝平.基于脂肪酶界面活化特性的固定化技术[D].杭州:浙江理工大学,2013:35-43.

[29]翁永珍.脂肪酶的化学修饰及其界面催化性能研究[D].无锡:江南大学, 2007:14-27.

The fusion expression and catalytic properties of theYarrowialipolyticalipase Lip2 and hydrophobin SC3

QIU Yu-long, DENG Dong-mei, PAN Shu-lan, SUN Yu-fei*

(Guangxi University of Science and Technology,School of Biological and Chemical Engineering,Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources, Liuzhou 545006,China)

In order to investigate hydrophobin fusion expression effects on lipase catalytic properties, recombinant plasmid PKL secreted greaseYersinialipolyticalipase Lip2, PKHL with His tag Lip2 and PKHLS carrying fusion protein of Lip2 and hydrophobin SC3 were constructed and respectively transformed intoPichiapastorisGS115 strain. After screening, the engineering strains with high expression were obtained. Fermentation broth of these 3 recombinant strains respectively with a relative molecular weight of 36 kDa, 36 kDa, 46 kDa showed hydrolase activity of 5.35U/mL, 4.69U/mL, 2.4U/mL with 4-nitrophenyl caprylate (p-NPC) as substrate at optimum temperature of 45 ℃ and the optimum pH of 7.5. The enzyme activities of KL and KHL strains were much higher than that of KHLS.

Yarrowialipolyticalipase；Schizophyllumcommunehydrophobin SC3；Pichiapastoris；surfactant；catalytic activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609004

硕士研究生(孙宇飞为通讯作者,E-mail：3893@163.com)。

广西自然科学基金项目(2014GXNSFBA118249)；广西高校科学技术研究项目(YB2014201)；广西科技大学大学生创新创业训练计划项目(201510594035)

2016-02-01，改回日期：2016-03-15