Acetobacter sp.驯化选育及固定化生产3-羟基丙酸

李俊，宗红，诸葛斌*，陆信曜，方慧英，宋健，董卓丽

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，工业微生物研究中心，江苏 无锡，214122)2(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡，214122)



Acetobactersp.驯化选育及固定化生产3-羟基丙酸

李俊1，宗红1，诸葛斌1*，陆信曜1，方慧英1，宋健2，董卓丽1

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，工业微生物研究中心，江苏 无锡，214122)2(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡，214122)

3-羟基丙酸作为最有价值的平台化合物之一，其自身及诸多衍生化合物被广泛应用于材料、纺织、食品工业及生物医药领域。利用Acetobactersp. 生物催化1,3-丙二醇(1,3-PDO)合成3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)的性能，通过梯度增加培养基中1,3-PDO浓度驯化选育Acetobactersp.，有效提高了该菌对底物的耐受性；同时利用固定化细胞的方法提高菌株对底物的耐受性和3-HP转化率，当包埋材料为30 g/L海藻酸钠和聚乙烯醇混合物、颗粒粒径2 mm，添加0.1 mmol/L Fe2+时，固定化细胞表现出最大的催化活性。10 g/L(CDW)固定化细胞可催化70 g/L 1,3-PDO为66.95 g/L 3-HP，催化水平是静息细胞的1.32倍，且固定化细胞经50 g/L底物循环利用5次后，3-HP摩尔转化率仍保持80.65%。固定化的醋酸菌类生物催化剂为工业上3-HP的实际生产提供了一种新可能。

驯化；固定化细胞；底物耐受性；3-羟基丙酸；Acetobactersp.

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是乳酸的同分异构体，非手性的结构使其具有更活泼的化学特性[1]，作为一种高附加值的新型三碳平台化合物，3-HP及其诸多高附加值的衍生物在食品、材料、纺织和医药等众多领域被广泛应用[2-3]。同时3-HP被美国能源部列为当前12种最具开发潜力的生物化工产品之一，位列其中第3位[4]。

目前，高效工业化合成途径的缺乏是3-HP仍未被规模化生产的主要原因。相比现有的化学合成法，微生物法合成3-HP具有反应条件温和、副产物少、操作简便等优点，是当下的研究热点。其中，生物转化法过程简单、转化率高，是极具潜力的一种3-HP生物合成途径[5]。已有的报道中，3-HP可由底物丙烯酸经Candidarugose[6]，Byssochlamyssp.[7]，Rhodococcuserythropolis[8]催化获得，然而丙烯酸和丙酸类底物本身对功能微生物的生长和活性有抑制作用，为此有必要寻找更多新的催化底物和催化合成路径。本研究室前期已筛选获得了1株以1,3-丙二醇(1,3-PDO)为底物高效转化合成3-HP的菌株Acetobactersp.，该菌株在最适条件下可将10 g/L 1,3-PDO转化为11.65 g/L 3-HP，摩尔转化率高达98.4%；然而，当1,3-PDO浓度提高到50 g/L时，菌体受底物抑制明显，静息细胞重复催化3次后摩尔转化率仅为12.4%[9]。因此，提高菌株底物耐受性、消除底物的抑制作用对生物催化法高效合成3-HP具有重要的实际意义。

本研究以Acetobactersp. 为研究对象，通过连续底物胁迫实验提高菌株对1,3-PDO的耐受性，同时利用固定化细胞技术进一步提高Acetobactersp. 的底物耐受性，并实现可重复利用生产，为工业化合成3-HP提供一种新方法。

1　材料与方法

1.1菌种和试剂

Acetobactersp. 为本研究室筛选获得；标准品1,3-PDO、3-HP为色谱纯，分别购于阿拉丁(上海)有限公司、Tokyo Chemical Industry公司，其他试剂均为分析纯。

1.2培养基及培养方法

种子培养基(g/L)：甘油12，蔗糖8，蛋白胨10，MgSO4·7H2O 1，KH2PO41。

发酵培养基(g/L)：甘油12，蔗糖8，蛋白胨10，MgSO4·7H2O 1，KH2PO41，L-α-丙氨酸1，丙酸1，FeCl2·H2O 0.1 mmol/L。

以φ=5%接种量将活化种子液接种至装液量为φ=20%的三角瓶液体培养基中，于30 ℃、200 r/min培养24 h。

1.31,3-PDO生长抑制临界浓度的确定

制备1,3-PDO终质量浓度分别为20、30、40、50、60、70、80 g/L的固体培养基梯度平板，涂布200 μL种子液后置于30 ℃恒温箱培养48 h，根据生长情况(单菌落个数)，确定1,3-PDO对原始菌株的临界致死浓度。

1.4菌株的驯化

根据确定的临界浓度制备梯度平板固体培养基。涂布接种原始菌株后，于30 ℃恒温培养箱中培养3～5 d后，挑取1,3-PDO浓度高一侧的单菌体至液体培养基中，再以此菌体重复上述胁迫培养，多次传代直至某子代菌株的底物耐受性明显增强。每代菌株均保菌冷藏备用。

1.5固定化细胞的制备

挑取单菌落于50 mL三角瓶中，30 ℃，200 r/min培养6 h。转接至500 mL三角瓶中，30 ℃，200 r/min培养20 h。将菌液于4 500 r/min离心30 min，小心倒出上清，生理盐水重悬后于7 000 r/min再次离心30 min，收获浓缩菌体细胞。与相应包埋材料溶液充分混匀后，混合液通过蠕动泵抽入接有针头的橡皮管并缓慢逐滴注入0.05 mol/L CaCl2中，形成均一稳定的球状颗粒。连接不同尺寸的针头以改变固定化颗粒的粒径大小。4 ℃静置备用。

1.6机械强度和染料浸染实验

单轴抗压实验：在相同制备条件下，取不同材料包埋菌体获得的固定化颗粒3颗，置于两载玻片之间，在分析天平上逐渐加力增压直至颗粒球形结构破裂形变，以天平显示的最大压力数值为固定化颗粒的机械强度值。

染料浸染实验：将固定化细胞颗粒置于一定浓度的结晶紫染料中1 min，再取出浸入纯水中1 min以除去表面的染料，显微切片后在10倍物镜下显微成像(Optec BK-FL4)，以成像像素(px)为单位测量浸染程度。

2组试验每次样品均重复10次并取平均值。

1.73-HP生物催化体系

在100 mL三角瓶中，将菌体终浓度为10 g CDW/L固定化颗粒置于含有适量浓度1,3-PDO的20 mL醋酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.0)中，30 ℃，200 r/min摇床进行生物转化。精确取样，HPLC检测底物和产物的含量。系统总质量差法定量反应体系体积的变化。

3-HP摩尔转化率：催化生成的产物3-HP与被催化的底物1,3-PDO的摩尔质量百分比。

1.8检测方法

1,3-PDO、3-HP的检测均采用高效液相色谱(Dionex Summit P680)法，色谱柱Bio-Rad Aminex HPX-87H，色谱分析条件：流动相5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，柱温60 ℃，进样量10 μL，紫外波长210 nm，示差检测器温度35 ℃，采用外标法定量。

2　材料与方法

2.1Acetobactersp. 耐1,3-PDO驯化

按照1.3的实验方法确定了1,3-PDO抑制Acetobactersp. 生长的临界浓度为50 g/L，并在此临界浓度下，经过连续9轮次的胁迫培养获得了驯化菌株。同条件下培养48 h后，原始菌株和驯化菌株在相同的梯度平板上生长状况如图1所示。1,3-PDO浓度随箭头方向由零递增至100 g/L，驯化菌株在超过临界浓度的平板上仍能够良好生长，表明其底物耐受性得到提升，能在后续的实际催化应用中耐受更高浓度的1,3-PDO。

图1　原始菌株(a)和驯化菌株(b)在梯度平板上的生长Fig.1　Growth conditions of original strain(a) and tamed strain(b) on gradient plate

利用原始菌株与驯化菌株的静息细胞进行了催化性能对比实验，结果如图2所示。

图2　原始菌株与驯化菌株的催化性能Fig.2　Biocatalytic properties of original strain and tamed strain

当1,3-PDO质量浓度为10～20 g/L时，原始菌株和驯化菌株催化性能相当。但是随着1,3-PDO浓度的逐渐增加，原始菌株的3-HP产量和转化率均低于驯化菌株。当底物质量浓度达到50 g/L时，驯化菌株的3-HP产量可达33.7 g/L，而原始菌株的产量仅为26.9 g/L。综上，通过菌株的驯化培养不仅提升了Acetobactersp. 的自身底物耐受性，3-HP催化性能也有所提升，驯化菌株更适用于高浓度1,3-PDO时的转化生产。

2.2细胞固定化

2.2.1包埋材料

分别以终质量浓度均为30 g/L的海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)及两者的混合物(SA+PVA)为包埋材料，制备固定化颗粒并考察各自催化性能。结果如图3所示，单一材料SA制备的固定化颗粒其染料浸染程度值为170 px，较PVA高28.57%，表明SA优于PVA的传质能力；而由PVA包埋的菌体颗粒机械强度则比SA高16.31%。固定化颗粒良好的传质性能有利于催化的进行，这与SA组的3-HP摩尔转化率达到最高值86.70%相符合。此外，利用两种材料的混合物包埋Acetobactersp. 时，虽然其3-HP摩尔转化率比单一材料SA略有降低，但混合材料较SA和PVA的机械强度有了明显提高(分别提高51.49%和30.24%)，染料浸染程度也比单一材料分别提高11.84%和43.80%，因此，我们选择终质量浓度为30 g/L的SA和PVA混合物作为Acetobactersp. 的包埋材料。

图3　不同包埋材料制备固定化细胞的物理性能和生物催化效率Fig.3　Physical properties and bioconversion efficiency of immobilized cells in different embedding materials

2.2.2金属离子

如图4(a)所示，催化体系中添加0.1 mmol/L Ca2+，Mg2+，Fe2+分别使固定化细胞的3-HP摩尔转化率增加了7.0%，5.2%和8.0%，而添加EDTA则使3-HP摩尔转化率降低36.8%。主导1,3-PDO氧化反应的功能酶为Acetobactersp. 细胞质膜上的PQQ依赖型醇脱氢酶(PQQ-ADHs)[10]，已有研究表明，这些脱氢酶中的Ca2+或Mg2+是核心组分之一，能够与PQQ活性位点结合，在脱氢酶结构成形中起到重要作用[11]。此外，PQQ自身的组成亚基就含有[2Fe-2S]簇和细胞色素c等必需成分[12-13]，因此添加Fe2+对这一催化过程有利。而EDTA则会引起金属螯合效应，明显地抑制了Acetobactersp. 的3-HP生物合成性能，这也从侧面验证了上述金属离子在此催化过程中的重要性。

2.2.3粒径大小

不同粒径大小的固定化颗粒的催化性能结果如图4(b)所示，3-HP的转化率随着颗粒直径的增加而逐渐降低，颗粒直径为1 mm 时转化率最高，为86.4%；而颗粒直径为5 mm时，3-HP转化率降低13.4%。这可能与Acetobactersp. 作为生物催化剂氧化1,3-PDO属于严格好氧过程有关，O2在这一过程作为最终电子受体是影响反应的关键因素，接受来自膜上脱氢酶氧化呼吸链的电子，与H+结合生成水，完成3-HP的合成[14]。然而，球形颗粒的比表面积与其粒径成反比，粒径的减小显然有利于O2和物质的传递，从而促进固定化细胞更高效的生物催化。另外，考虑到固定化颗粒制备的难度，我们选择2 mm为后续实验的最适粒径大小。

图4　金属离子和粒径大小对固定化细胞催化性能的影响Fig.4　Influences of metal ions and biocapsules diameter on catalytic efficiency of immobilized cells

2.3固定化细胞的性能

2.3.1固定化细胞的底物耐受性

分别利用静息细胞和固定化细胞对不同浓度的1,3-PDO进行催化，结果如图5所示。在10、20 g/L的低1,3-PDO浓度下，静息细胞较固定化细胞有更高的转化性能，这可能与固定化细胞的传质性能有关。而当底物浓度进一步增大后，静息细胞的底物抑制作用明显，催化性能降低，而固定化细胞则在70 g/L的高底物浓度下依旧保持80.27%的摩尔转化率，是同等浓度下静息细胞催化水平的1.32倍。由此可见，细胞的固定化可有效提升Acetobactersp. 在高浓度底物下的催化性能。

图5　不同底物初试浓度下静息细胞和固定化细胞的催化性能Fig.5　Catalytic characteristics of resting cells and immobilized cells at different initial substrate concentrations

2.3.2热稳定性和pH稳定性

通过包埋法获得的固定化细胞Acetobactersp.具有良好的操作稳定性。在不同温度下固定化细胞催化性能随贮存时间的变化情况如图6(a)所示。在4 ℃贮存超过100 h后仍保持3-HP摩尔转化率为82.2%，在20 ℃和30 ℃下长期贮存也能保持较高的催化性能，而在37 ℃贮存40 h后则急剧下降。固定化细胞在不同pH的醋酸缓冲液(pH 3.0，4.0，5.0和6.0)和Tris-HCl缓冲液(pH 7.0，8.0和9.0)中相对转化率如图6(b)所示。以pH 7.0的最高转化率为对照，当pH > 7.0时，固定化细胞经过60 h的催化仍保持83.69%的相对转化率，而pH低至3.0时也高达85.85%，说明固定化后的细胞具有良好的pH稳定性。

图6　固定化细胞热稳定性(a)和pH稳定性(b)Fig.6　Thermal stability (a) and pH stability (b) of immobilized cells

2.3.3重复利用性

在1,3-PDO浓度为50 g/L的反应体系中，在最适反应条件(30 ℃，pH 7.0，200 r/min)下连续催化60 h作为一个批次，收集固定化细胞置于生理盐水中除去残留底物产物后，重新添加50 g/L 1,3-PDO进行下一批次催化，结果如图7所示。

图7　固定化细胞的重复利用Fig.7　Recycling utilization of immobilized cells

固定化颗粒的3-HP摩尔转化率随批次增加而缓慢降低，但经过5轮(300 h)连续催化仍达到80.65%，表明固定化细胞能够很好地保持Acetobactersp. 的催化活性，可循环利用性好，为实际生产合成3-HP提供了重要参考。

3　结论

本文利用Acetobactersp. 的生物催化性能，通过在培养基中添加高浓度的底物1,3-PDO进行连续胁驯化培养，获得了底物耐受性及3-HP转化性能均有增强的驯化菌株。同时利用细胞固定化技术进一步提升生物催化反应的底物耐受浓度。当包埋材料SA和PVA终浓度为30 g/L、颗粒粒径2 mm，并添加0.1 mmol/L Fe2+时，固定化细胞表现出最大的催化活性。70 g/L 1,3-PDO经固定化细胞催化转化为66.95 g/L3-HP，摩尔转化率为静息细胞的1.32倍。此外，固定化颗粒具有良好的热稳定性和pH稳定性，高浓度底物循环利用5次后，3-HP摩尔转化率仍保持80.65%。本研究通过驯化选育和细胞固定化的方法有效提高了Acetobactersp. 对底物1,3-PDO的耐受性，为生物催化法工业化生产3-HP提供了一种可能。

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Domestication and immobilization ofAcetobactersp.for 3-hydroxypropionic acid bioproduction

LI Jun1,ZONG Hong1,ZHUGE Bin1*,LU Xin-yao1,FANG Hui-ying1,SONG Jian2,DONG Zhuo-li1

1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Laboratory of Industrial Microorganisms,School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(School of Chemical and Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

As one of the important chemical platform organics, 3-hydroxypropionic acid (3-HP) and a plenty of its derivatives were widely utilized in the fields of materials, textile, food and biomedicine. Based on the property of 3-HP synthesis from 1,3-propanediol(1,3-PDO) oxidation using biocatalystAcetobactersp., the substrate tolerance of domesticated strain was effectively promoted via gradient addition of 1,3-PDO in plate culture medium. Whole cell immobilization was also used for adaption of high concentration substrate and elevation of 3-HP conversion efficiency. Biocapsules with 2 mm diameter were embedded by 30 g/L compound of sodium alginate and polyvinyl alcohol. Then the maximum catalytic activity of immobilized cells was obtained after addition of 0.1 mmol/L Fe2+invitro. Under the reaction condition of 10 g/L (CDW) cell concentration, pH 7.0 and 30 ℃, 3-HP molar conversion of immobilized cells was 1.32 fold higher than that of resting cells and reach maximum production of 66.95 g/L 3-HP converted from 70 g/L 1,3-PDO. After 5 times of recycle use, immobilized cells biotransformed 50 g/L 1,3-PDO continuously over 300 h and maintained a 3-HP molar conversion of 80.65%. A new alternative method for industrial 3-HP production was provided when acetic acid bacteria were used as immobilized biocatalysts.

domestication; immobilized cells; substrate tolerance; 3-hydroxypropionic acid;Acetobactersp.

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609007

硕士研究生(诸葛斌教授为通讯作者,E-mail：Bzhuge@163.com)。

江苏省青年自然科学基金(BK20140134)；国家自然科学基金(31570052)

2016-01-26，改回日期：2016-04-03