橙皮苷对IgA肾病大鼠肾脏组织中Nephrin蛋白表达的影响研究

陈明喆，何　伟

(1. 鄂东医疗集团黄石市中心医院，湖北 黄石 435000；2. 湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435000)



论著

橙皮苷对IgA肾病大鼠肾脏组织中Nephrin蛋白表达的影响研究

陈明喆1，2，何伟1，2

(1. 鄂东医疗集团黄石市中心医院，湖北 黄石 435000；2. 湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435000)

目的探讨橙皮苷对IgA肾病大鼠肾脏组织中Nephrin表达是否有调节作用及其作用机制。方法选取雄性SD大鼠60只，适应性喂养2周后随机分为正常组、模型组和橙皮苷组，每组20只。除正常组外，其余组均造模。造模成功后，橙皮苷组给予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃，模型组和正常组给予生理盐水1 mg/(kg·d)灌胃，均1次/d。分别于造模6周、10周及灌胃干预4周、8周检测各组大鼠尿红细胞计数；分别于灌胃干预4周、8周检测24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮水平，采用免疫组化、Western blot法检测肾脏组织中Nephrin蛋白表达情况，采用RT-PCR法检测肾脏组织中Nephrin mRNA表达情况。结果与正常组相比，模型组大鼠毛发杂乱，饮食减少，橙皮苷组干预后毛色、饮食进水及活动度较模型组有一定改善。造模6周、10周及灌胃干预4周、8周，模型组和橙皮苷组尿红细胞计数均明显高于正常组(P均<0.05)；灌胃干预4周、8周后，橙皮苷组尿红细胞计数均明显低于模型组(P均<0.05)。灌胃干预4周、8周后，模型组24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮水平均明显高于正常组 (P均<0.05)，Nephrin蛋白和mRNA表达均明显低于正常组(P均<0.05)；灌胃干预4周后，橙皮苷组24 h尿蛋白定量和尿素氮水平均明显低于模型组(P均<0.05)，Nephrin蛋白和mRNA表达均明显高于模型组(P均<0.05)；灌胃干预8周后，橙皮苷组24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮水平均明显低于模型组(P均<0.05)，Nephrin蛋白和mRNA表达均明显高于模型组(P均<0.05)。结论橙皮苷能明显降低IgA肾病大鼠24 h尿蛋白定量，减少尿红细胞计数，保护肾功能，这可能与其可上调肾脏组织中Nephrin 蛋白和mRNA 的表达有关。

橙皮苷；IgA肾病；肾功能；Nephrin蛋白

IgA肾病(IgAN)是临床中最为常见的一种原发性肾小球疾病，好发于青少年，积极救治多数较易康复，但其中约有30%的患者康复困难，这与其发病机制较为复杂有关[1]。本病症状较为典型，一般患者表现有血尿或者镜下有30%的红细胞即可怀疑，经肾活检如患者有明显的肾小球系膜区IgA颗粒物沉积即可确诊[2]。该病可以继发于过敏性紫癜、酒精性肝硬化以及肿瘤等疾病[3]。目前西药治疗本病多以降压+激素治疗为主，这可能会对患者今后的健康有一定影响[4]。而中药治疗本病有独特的优势，但是在现代化推广时，面临着药物成分众多，治疗机制不明确的困境[5]。橙皮苷是从橙皮中提取的一类苷类单体化合物，目前已有用橙皮苷治疗肾病的研究报道[6]，但是关于其治疗IgA肾病的研究报道少见。因此本研究观察了橙皮苷对IgA肾病大鼠肾脏组织中Nephrin表达是否有调节作用及其作用机制，旨在为今后中药的开发和本病的治疗提供参考。

1　实验资料

1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠60只，购于华中科技大学同济医学院动物实验中心，体质量180～200 g，动物合格证号：SCXK(鄂)2011-0007。所有大鼠在购买后均饲养于不锈钢鼠笼内，常规饲料由华中科技大学动物实验中心提供，饮用水为纯水，饲养于动物饲养间，设置温度为20～24 ℃，日照和光照共计12 h。

1.2主要试剂橙皮苷购于湖北合天化工有限公司；脂多糖和牛血清白蛋白购于美国Sigma公司；四氯化碳和蓖麻油购于中国国药公司；免疫组化试剂盒、总蛋白提取试剂盒以及PCR定量试剂盒购于武汉谷歌生物科技有限公司；Nephrin抗体购于美国Santa公司；β-actin购于EPIT Mics公司；Nephrin引物由上海生工生物公司设计并生产。

1.3实验方法大鼠在适应性喂养2周后随机分为正常组、模型组以及橙皮苷组，每组20只。除正常组外，其余2组大鼠均根据文献[7]方法进行造模：采用隔日的血清白蛋白400 mg/(kg·d)灌胃，1次/d,持续6周；同时每周注射1次0.5 mL蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，共9周，分别于第6周和第8周尾静脉注射脂多糖0.05 mg；10周后观察大鼠是否造模成功。造模成功后，橙皮苷组给予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃，模型组和正常组给予生理盐水1 mg/(kg·d)灌胃，1次/d,分别于灌胃干预4周、8周后处死大鼠各半进行指标观察。

1.4观察指标

1.4.1大鼠一般情况实验过程中观察大鼠体质量、毛色、精神状态、饮食量以及日常活动情况。

1.4.224 h蛋白尿定量及尿红细胞计数分别于造模6周、10周以及灌胃干预4周、8周后用大鼠代谢笼收集各组大鼠尿液，采用磺柳酸-硫酸钠比浊法测定24 h蛋白尿定量，采用尿沉渣计数法检测尿红细胞计数。

1.4.3血肌酐(SCr)以及尿素氮(BUN)水平处死大鼠后，用注射器沿大鼠心尖处取血，取血后立即4 000 r/min离心，离心后收集血清，将其置于超低温冰箱保存，由黄石市中心医院检验科检测SCr和BUN水平。

1.4.4显微镜下肾组织Nephrin表达检测血清收集后立即取出大鼠肾脏组织，统一切取约1/4左肾脏(其余组织置于超低温冰箱中备用于检测Nephrin蛋白和mRNA表达情况)，置于中性福尔马林溶液中固定。然后取出洗净，将其置于融化的石蜡中包埋，切片，置于65 ℃烘箱中烘片2 h脱蜡，之后用PBS洗涤3次，每次5 min。将洗净后的切片置于EDTA缓冲液中修复，待其修复后自然冷却，再用PBS洗涤3次，每次5 min。将切片置于3%的双氧水孵育10 min后，用 PBS洗涤3次，每次5 min。将切片用5%BSA蛋白封闭20 min，之后加入一抗过夜，用 PBS洗涤3次，每次5 min。之后加入二抗孵育50 min，再用PBS洗涤3次，每次5 min。用DAB溶液滴加于切片上，显微镜下控制颜色，待颜色适宜后用自来水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗，氨水返蓝后冲洗即完成。切片脱水并干燥，之后用二甲苯透明，中性树胶封固。带有照相功能的显微镜下照片采样。

1.4.5肾组织Nephrin mRNA检测采用半定量RT-PCR法检测。称取30 mg肾脏组织，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，提取后定量调平，之后行逆转录以及扩增反应，Nephrin引物设计：上游为5’-GATCGCGAGCTAAATACGGCA CC-3’，下游为5’-TGGGAACGCAGCCAGACGACTC-3’，产物长度为312 bp；β-actin上游为5’-CAGAGGAGCCTCCTGTCCAGCTCTCAT-3’，下游为5’-GCTTGA CCAAGCCGCTTCGGTGCAC，产物长度为631 bp。反应条件为94 ℃预变性2 min，之后同样温度变性30 s，48.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；最后再延伸5 min。完成后每组各取2 μL进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后采用凝胶成像仪照片，并分析电泳带灰度值，全组以β-actin为内参，每组实验重复3次。

1.4.6肾组织Nephrin蛋白表达检测采用Western blot法检测。首先用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，之后BCA法定量调平，最后再测定1次，当总蛋白基本位于(100±5)%后再进行以下实验。实验时每组各取50 μg进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后切取目标蛋白转移到PVDF膜上(美国Santa公司)，转移后用脱脂牛奶封闭2 h，洗涤3次后加入一抗过夜，洗涤后加入二抗2 h后再洗涤，最后进行ECL荧光照片，以β-actin 作为内参，凝胶成像仪分析系统扫描并定量胶片条带灰度值，每组实验重复3次。

2　结　　果

2.1各组大鼠一般情况造模前所有大鼠均灵活好动，同时毛发顺畅且致密有光泽，饮食均正常；造模第6周可见造模大鼠均出现明显消瘦，饮食和饮水及活动量均明显减少，同时毛色发黄、稀疏；橙皮苷组给予橙皮苷干预后，相较于正常组依然较为消瘦，但毛发稀疏情况较模型组有明显改善，饮食和饮水均有一定的增加。

2.2各组造模6周、10周及灌胃干预4周、8周后大鼠尿红细胞计数比较造模6周、10周后，模型组和橙皮苷组尿红细胞计数均明显高于正常组(P均<0.05)。橙皮苷组给予橙皮苷干预4周、8周后，尿红细胞计数均明显低于模型组(P均<0.05)，但仍明显高于正常组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组造模6周、10周及灌胃干预4周、8周后大鼠尿红细胞计数比较±s，个)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.3各组灌胃干预4周和8周后肾功能指标比较灌胃干预4周和8周后，模型组和橙皮苷组血清SCr、BUN和24 h尿蛋白定量均明显高于正常组(P均<0.05)；灌胃干预4周后，橙皮苷组BUN和24 h尿蛋白定量均明显低于模型组(P均<0.05)；灌胃干预8周后，橙皮苷组SCr、BUN和24 h尿蛋白定量均明显低于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组灌胃干预4周和8周后肾功能指标比较±s)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.4各组灌胃干预4周和8周后免疫组化表现肾脏组织中Nephrin蛋白主要表达于细胞间隙之间，在细胞核中几乎没有表达。灌胃干预4周和8周后，模型组肾脏组织中Nephrin蛋白表达均明显少于正常组；灌胃干预4周后，橙皮苷组肾脏组织中Nephrin表达有一定升高，干预8周后相较于干预4周后进一步升高。见图1。

图1　灌胃干预4周、8周后各组肾脏组织中Nephrin免疫组化表现(10×20)

2.5各组灌胃干预4周和8周后肾脏组织中Nephrin蛋白和mRNA表达情况灌胃干预4周和8周后，模型组和橙皮苷组肾脏组织中Nephrin蛋白和mRNA表达量均明显低于正常组(P均<0.05)；灌胃干预4周、8周后，橙皮苷组肾脏组织中Nephrin蛋白和mRNA表达量均明显高于模型组(P均<0.05)。见图2～5和表3。

图2　灌胃干预4周后各组大鼠肾脏组织中Nephrin蛋白表达情况

图3　灌胃干预8周后各组大鼠肾脏组织中Nephrin蛋白表达情况

3　讨　　论

IgA肾病是严重威胁人们健康的一种疾病，其发病机制尚未完全阐明[8]。现有的证据显示，免疫反应、遗传、氧化应激、炎症反应等均直接或间接参与了该病的发生和发展[9-11]。

图4　灌胃干预4周后各组大鼠肾脏组织中Nephrin mRNA表达情况

图5　灌胃干预8周后各组大鼠肾脏组织中Nephrin mRNA表达情况

组别nNephrin蛋白灌胃干预4周后灌胃干预8周后NephrinmRNA灌胃干预4周后灌胃干预8周后正常组101.22±0.321.34±0.381.16±0.311.31±0.42模型组100.49±0.14①0.62±0.13①0.39±0.19①0.61±0.23①橙皮苷组100.69±0.22①②1.04±0.19①②0.65±0.21①②1.17±0.33①②

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

由于IgA本身是一种免疫球蛋白，所以认为其是IgA肾病发病的关键，但是为何种原因引起的IgA分泌异常还没有完全阐明。有研究显示IgA肾病具有家族和种族遗传性，我国该病的发病率明显高于西方国家，推测遗传因素或者说是家族性的基因缺陷是导致本病发生的根本[12]。目前西医对于IgA肾病尚无标准的治疗方法，临床中除控制血压和减少蛋白尿外，部分患者还给予激素治疗，而激素治疗不良反应大[13]，给患者带来了严重的身心负担。祖国传统医学治疗核心首先为寻找不良反应较少的药物，但是祖国医药多以中药汤剂治疗为主，在进行国际化推广时，面临着一定的困难，这主要与中药汤剂成分复杂、药理学不明有关，因此研究中药提取物作用意义重大。

近些年来，我国各中医药大学和机构引进大量生物和基础医学人才，这些人才的引进将生物医疗技术带到了中药学界，其提取的众多中药单体或化合物用于治疗IgA肾病也收到了明显效果[14-15]。橙皮是我国经典的药物之一，其具有理气化痰、健脾导滞之功效，此外其对胸腹胀痛、感冒咳嗽以及食欲不振等也具有很好的疗效[16]。橙皮苷是从橙皮中提取的一类化合物，其在维持患者的渗透压、增强毛细血管的韧性、降低胆固醇及对糖尿病和心脑血管的辅助治疗方面具有很好的疗效[17]。本研究结果显示，橙皮苷可改善IgA肾病大鼠善肾功能，降低24 h尿蛋白定量，减少尿液中红细胞计数。

Nephrin蛋白是肾小球基底膜中常见的一种蛋白，也是足细胞中的一种重要衔接蛋白，其仅表达于胎儿和成人的肾脏组织，是肾脏的专一性蛋白，对维持肾脏的功能起着举足轻重的作用[18]。有研究显示，Nephrin可以黏附于足细胞表面，进而维持足细胞中肌动蛋白的功能，增强足细胞滤过功能[19]。本研究结果显示，模型组肾脏组织中Nephrin蛋白和mRNA表达量明显低于正常组，这可能是造成IgA肾病大鼠尿红细胞计数增多的原因；橙皮苷干预后，肾脏组织中Nephrin蛋白和mRNA表达量均明显高于模型组，从而提高了肾脏足细胞的肌动性，最终减少了尿液红细胞的排出。

综上所述，橙皮苷能明显降低IgA肾病大鼠24 h尿蛋白定量，减少尿红细胞计数，保护肾功能，这可能与其可上调肾脏组织中Nephrin蛋白和mRNA的表达有关。

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Study on the effect of Hesperidin on the expression of Nephrin in renal tissue of rats with IgA nephropathy

CHEN Mingzhe1,HE Wei1,2

(1. Huangshi Central Hospital,Huangshi 435000, Hubei, China;2.The Medical College of Hubei Polytechnic University,Huangshi 435000, Hubei, China)

Objective It is to investigate whether hesperidin has regulation on Nephrin expression in kidney tissue in IgA nephropathy rats. Methods After adaptive feeding for 2 week, 60 male SD rats were randomly divided into normal group, model group and hesperidin treatment group, each group had 20 rats. Except normal group, model establishing was performed in the other groups.After successful model establishing, hesperidin treatment group was given hesperidin 10 mg/(kg·d) by lavage, while model group and normal group were given normal saline once per day.Urine red blood cell element was detected in 6, 10 weeks after model establishing and at 4 and 8 weeks’ intervention in every group, and 24 h urine protein, serum creatinine and urine nitrogen content were determined at 4 and 8 weeks’ intervention. Immunohistochemistry, Western blot and RT-PCR were used to detected the Nephrin mRNA and protein expression.Results Compared with normal group,the rats in model group was messy hair, their diet significantly reduced. After treatment, the rats’ hair color, diet intake and activity were improved in hesperidin treatment group compared with model group.Compared with normal group, urine red blood cells increased significantly in model group and treatment group(P<0.05), but after intervention it was lower in treatment group than that in model group(P<0.05). Compared with normal group, 24 h urinary protein, serum creatinine and urea nitrogen increased significantly in the other two groups.After 4 and 8 weeks’ intervention, the levels of 24 h urinary protein and urea nitrogen were lower while the levels of Nephrin protein and mRNA expression were significantly higher in treatment group than that in model group(P<0.05); After 8 weeks of treatment, the level of serum creatinine was also lower two (P<0.05). further increased. Conclusion Hesperidin can obviously reduce 24 hours urine protein of the IgA nephropathy rats, and decrease the urine red blood cell count, protect renal function, the mechanism may be related with up-regulation of the expression of Nephrin mRNA and protein in kidney tissue.

Hesperidin; IgA nephropathy; renal function; Nephrin Protein

陈明喆，女，硕士，主治医师，研究方向为中西医结合治疗肾脏病。

何伟，E-mail:hsyiyuantougao@163.com

湖北省卫生厅资助项目(2014HS017)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.26.001

R-332

A

1008-8849(2016)26-2851-05

2016-05-05