放化疗联合热疗治疗中晚期宫颈癌的疗效及对CD4+T细胞平衡失调的影响

杨晓杰，范凌霞，宋俊霞，谢　娅

(1. 河南省焦作市焦煤中央医院，河南 焦作 454000；2. 郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450000)



放化疗联合热疗治疗中晚期宫颈癌的疗效及对CD4+T细胞平衡失调的影响

杨晓杰1，范凌霞1，宋俊霞1，谢娅2

(1. 河南省焦作市焦煤中央医院，河南 焦作 454000；2. 郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

目的观察同步热放化疗治疗中晚期宫颈癌的临床疗效及对体内CD4+T细胞平衡失调的影响。方法将200例中晚期宫颈癌患者随机分为2组，同步放化疗组(CRT组)给予同步放化疗治疗，深部热疗加同步放化疗组(H+CRT组)在同步放化疗基础上给予盆腹腔深部局部热疗，比较2组临床疗效及生存期。同时选择同期健康体检女性100例作为健康对照组，检测健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞百分率及IFN-γ、FoxP3蛋白水平和IL-4、IL-17水平。结果H+CRT组临床总有效率明显高于CRT组(P<0.05)，生存期明显长于CRT组(P<0.05)。与健康对照组比较，宫颈癌患者外周血Th1细胞百分率、Th17/Treg比值及IFN-γ蛋白水平均明显降低(P均<0.05)，Th17、Treg细胞百分率及FoxP3蛋白水平和IL-17、IL-4水平均明显升高(P均<0.05)，虽然Th2细胞百分率与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但是Th1/Th2比值明显低于健康对照组(P<0.05)，出现Th1/Th2漂移。治疗后，Th1、Th2、Th17、Treg细胞百分率及IFN-γ、FoxP3蛋白水平和IL-4、I-17水平均明显恢复(P均<0.05)，且H+CRT组各指标恢复程度明显优于CRT组(P均<0.05)。结论中晚期宫颈癌患者体内出现CD4+T细胞平衡失调，热疗可以通过纠正CD4+T细胞的水平达到抗肿瘤的目的。

宫颈癌；中晚期；CD4+T细胞；热疗

随着人们思维方式和生活理念的变化，致使宫颈癌成为仅次于乳腺癌的导致女性死亡的高发恶性肿瘤，并有年轻化的趋势。目前研究尚无法完全阐明宫颈癌的发病机制，但“肿瘤患者机体处于免疫抑制状态”这一说法得到广泛认同。CD4+T细胞在抗肿瘤免疫中的作用凸显，有证据表明CD4+T细胞对肿瘤产生毒副作用，可直接遏制或灭杀肿瘤细胞[1-2]。因此，常认为CD4+T细胞的激活是肿瘤免疫治疗成败的关键因素，如果能够通过各种治疗技术来干预宫颈癌患者CD4+T细胞的激活，那么很有可能会提高机体抗肿瘤免疫、清除肿瘤细胞的功能。近30年热疗技术发展迅速，逐渐成为又一全新的治疗肿瘤的方法，其不但可以灭杀肿瘤细胞，提高患者生存质量，通过提高机体的免疫力而发挥增效放化疗的作用，同时也可减轻放化疗的不良反应，该方法被视为“绿色疗法”[3]。但热疗增效放化疗治疗宫颈癌的机制尚不明确，笔者认为可能以CD4+T细胞进行桥接，为了证实这一猜想，本研究对200例中晚期宫颈癌患者进行研究，旨在为同步热放化疗用于治疗中晚期宫颈癌提供理论依据。

1　临床资料

1.1一般资料选择2009年1月—2014年1月在焦煤中央医院初次就诊并经组织病理学确诊的宫颈癌患者200例，年龄<75岁，Karnofsky评分≥70分，参照FIGO分期标准处于Ⅱb期～Ⅲb期；无心、脑、肾等重大脏器疾病，且无转移。排除具有免疫缺陷性疾病者；出现严重并发症者；治疗过程中不予合作者。随机分为2组：同步放化疗组(CRT组)100例，年龄28～53(50.2±6.3)岁；肿瘤直径1.8～8.5(5.7±1.5)cm；病理类型:鳞癌91例，腺癌6例，腺鳞癌3例；组织分级：Ⅱb期58例，Ⅲa期20例，Ⅲb期15例，Ⅳa期7例。深部热疗加同步放化疗组(H+CRT组)100例，年龄32～56(49.6±5.2)岁；肿瘤直径1.4～8.3(5.8±1.7)cm；病理类型：鳞癌96例，腺癌3例，腺鳞癌1例；组织分级：Ⅱb期62例，Ⅲa期18例，Ⅲb期13例，Ⅳa期7例。2组年龄、病程、病理类型、组织分级比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。同时选择同期健康体检女性100例作为健康对照组。本研究方案经过医院伦理学委员会审查批准，所有受试对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2治疗方法

1.2.1CRT组采用全盆野常规分割外照射放疗法，1.8 Gy/次，每周连续治疗5 d，1次/d。当照射量达到DT 30.6 Gy后，于全盆野中央挡铅(4～5)cm×(10～11)cm，继续照射DT 14.4 Gy，DT总量为45 Gy(1.8 Gy/次×25次 )。之后行常规妇科检查，若宫旁肿瘤消退情况不理想，则增加全盆野中央挡铅照射3次，照射量波动在45～50.4 Gy。DT达到27 Gy后(照射放疗15次)，增加腔内照射，每周1次，7 Gy/次，连续治疗7次，A 点剂量42 Gy。如果患者瘤体较大，则照射放疗前先行阴道盒消瘤2次，源旁1 cm，10 Gy/次。照射放疗1周后行同步化学治疗，顺铂(DDP)40 mg/m2静脉滴注，1次/周，连续治疗6周。

1.2.2H+CRT组放化疗方案同CRT组，在化疗开始当天给予盆腹腔深部局部热疗(UHR-2000型微波热疗机，湖南华源医疗设备有限公司)，60 min/次，体心温度波动于41.8～42 ℃，1次/周，连续治疗4周。

1.3观察指标

1.3.1临床疗效治疗结束后根据实体瘤疗效评价标准(RECIST)判定疗效。完全缓解(CR)：治疗后所有肿瘤病灶全部消失，且未见新病灶，并维持4周；部分缓解(PR)：治疗后病灶体积缩小程度超过30%，并维持4周；稳定(SD)：治疗后病灶体积缩小程度未达到30%，或者治疗后病灶体积出现增大，但未超过20%；进展(PD)：治疗后病灶体积增大超过20%，或出现新病灶。CR+PR为临床总有效。

1.3.2外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞百分率及IFN-γ、FoxP3蛋白水平和IL-4、I-17水平

1.3.2.1主要试剂与仪器RPMI 1640培养基(美国Thermo公司)，胎牛血清(美国Thermo公司)；人淋巴细胞分离液 (天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；佛波醇乙酯(PMA)，离子霉素(Ion美国Sigma公司)，布雷杆氏菌素A(BFA 美国eBiosclence公司)，破膜剂，酶标仪，流式染色缓冲液CD4-FITC、IFN-γ-PE、IL-4-APC、IL-17A-APC、Foxp3-PerCP-Cy 5.5等流式抗体(均购自美国eBiosclence公司)，Transwell 小室(0.1 μm， 北京乐博生物技术有限公司)，流式细胞仪(德国Partec GmbH ，YZB/GEM 946-40型)；IFN-γ及FoxP3单克隆抗体(购自美国CST公司)，IL-4、IL-17酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国eBioscience公司)。

1.3.2.2标本采集及细胞分离分别抽取健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后前臂外周抗凝血10 mL，用人淋巴细胞分离液提取外周血单核细胞(PBMC，1×106mL-1)400 μL，均分为2份，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中用于流式检测。

1.3.2.3Th1、Th2、Th17以及Treg细胞流式检测加入刺激剂PMA及离子霉素工作液，使其终浓度分别为50 ng/mL、1 μg/mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4～6 h，再加入终浓度为2 μg/mL BFA，再次置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h，将培养皿中细胞收集至EP管，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗离心收集细胞，在4 ℃、500×g条件下离心3 min，摒弃上清液。再使用100 μL流式染色缓冲液重悬细胞30 min后加入CD4-FITC流式抗体各5 μL，避光4 ℃环境中孵育30 min，再加入流式染色缓冲液1 mL洗涤1次，在4 ℃、500×g条件下离心3 min，摒弃上清液，再加入600 μL破膜剂，避光4 ℃环境中孵育30 min后预冷PBS冲洗1次，再用100 μL破膜剂重悬细胞后加入2 μL藻红蛋白标记的各T淋巴细胞亚群相对应的标记物(IFN-γ-PE、IL-4-APC、IL-17A-APC、Foxp3-PerCP-Cy5.5)，避光4 ℃环境中孵育30 min，再用1 mL破膜剂冲洗1次后使用预冷PBS 200 μL重悬细胞，操作按试剂盒说明书进行，采用流式细胞仪检测各细胞。

1.3.2.4IFN-γ及FoxP3蛋白水平检测将流式细胞仪筛选的细胞加入100μL裂解液，4℃持续振摇30min，离心(12 000 r/min ，20 min)后，将上清转入预冷的离心管，考马斯亮兰法测定蛋白水平。灌制SDS-PAGE凝胶，凝固后按照说明安装电泳，每孔上样等体积样品与Marker，将凝胶置于100 V电压电泳槽中进行电泳，电泳后用380 mA电流将蛋白转移至硝酸纤维素滤膜，滤膜经5%脱脂奶粉封闭1 h后，剪膜，根据分子量分开后分别以加1∶500稀释的一抗(IFN-γ及FoxP3)及内参抗体(β-acting，1∶3 000)室温孵育2 h，洗膜，HRP标记羊抗兔二抗以1∶2 000稀释，继续孵育2 h，TBST漂洗，取出膜，滴加DAB显色液，5 min后封膜，洗片，扫描记录结果，Gel-analyze分析软件分析条带灰度。

1.3.2.5IL-4、IL-17水平检测将适量流式细胞仪筛选的细胞液在4 ℃条件下进行3 000×g离心5 min后用高压枪头吸取离心后的上清液，按照IL-4、IL-17 ELISA试剂盒说明书进行检测。

2　结　　果

2.1CRT组和H+CRT组疗效及生存率比较完成治疗后， H+CRT组临床总有效率明显高于CRT组(P<0.05)，见表1。CRT组中位生存期40.23个月,H+CRT组中位生存期59.12个月，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

表1　CRT组和H+CRT组近期疗效比较　　例(%)

注：①与CRT组比较，2=3.48，P<0.05。

图1CRT组和H+CRT组患者生存曲线

2.2健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后外周血中Th1、Th2细胞百分率及二者比值比较治疗前，CRT组和H+CRT组CD4+IFN-γ+细胞百分率和IFN-γ/IL-4比值均明显低于健康对照组(P均<0.05)，CRT组和H+CRT组比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，CRT组和H+CRT组CD4+IFN-γ+细胞百分率和IFN-γ/IL-4比值均明显高于治疗前(P均<0.05)，且H+CRT组明显高于CRT组(P均<0.05)，但仍均低于健康对照组(P均<0.05)。CRT组和H+CRT组治疗前后CD4+IL-4+细胞百分率与健康对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2　健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后外周血中Th1、Th2细胞百分率及二者比值比较±s)

注：①与健康对照组比较，P<0.05；②与治疗前比较，P<0.05；③与CRT组比较，P<0.05；④与健康对照组比较，P<0.05。

2.3健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后外周血中Th17、Treg细胞百分率及二者比值比较治疗前，CRT组和H+CRT组CD4+IL-17+和CD25+Foxp3+细胞百分率均明显高于健康对照组(P均<0.05)，CD4+IL-17+/CD25+Foxp3+明显低于健康对照组(P均<0.05)。治疗后，CRT组和H+CRT组CD4+IL-17+和CD25+Foxp3+细胞百分率均明显低于治疗前(P均<0.05)，且H+CRT组明显低于CRT组(P均<0.05)，但仍均明显高于健康对照组(P均<0.05)；CRT组和H+CRT组CD4+IL-17+/CD25+Foxp3+明显高于治疗前(P均<0.05)，且H+CRT组明显高于CRT组(P均<0.05)，但仍均明显低于健康对照组(P均<0.05)。见表3。

表3　健康对照组及H+CRT组、CRT组治疗前后外周血中Th17、Treg细胞百分率及二者比值比较

注：①与健康对照组比较，P<0.05；②与治疗前比较，P<0.05；③与CRT组比较，P<0.05；④与健康对照组比较，P<0.05。

2.4健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后外周血IFN-γ及FoxP3蛋白水平比较治疗前，CRT组和H+CRT组IFN-γ蛋白水平均明显低于健康对照组(P均<0.05)， FoxP3蛋白水平均明显高于健康对照组(P均<0.05)。治疗后，CRT组和H+CRT组IFN-γ蛋白水平均明显高于治疗前(P均<0.05)，且H+CRT组明显高于CRT组(P均<0.05)，但仍均低于健康对照组(P均<0.05)；CRT组和H+CRT组FoxP3蛋白水平均明显低于治疗前(P均<0.05)，且H+CRT组明显低于CRT组(P均<0.05)，但仍均高于健康对照组(P均<0.05)。见表4。

2.5健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后外周血IL-17及IL-4水平比较治疗前，CRT组和H+CRT组IL-17及IL-4水平均明显高于健康对照组(P均<0.05)。治疗后，CRT组和H+CRT组IL-17及IL-4水平均明显低于治疗前(P均<0.05)，且H+CRT组均明显低于CRT组(P均<0.05)，但仍均高于健康对照组(P均<0.05)。见表5。

表4　健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后外周血IFN-γ及FoxP3蛋白水平比较

注：①与健康对照组比较，P<0.05；②与治疗前比较，P<0.05；③与CRT组比较，P<0.05；④与健康对照组比较，P<0.05。

表5健康对照组及CRT组、H+CRT组治疗前后外周血IL-17及IL-4水平比较

注：①与健康对照组比较，P<0.05；②与治疗前比较，P<0.05；③与CRT组比较，P<0.05；④与健康对照组比较，P<0.05。

3　讨　　论

热疗是继外科手术、放化疗及生物治疗之后又一治疗肿瘤的全新“绿色疗法”，但其治疗肿瘤的机制目前尚处于探索阶段。在本研究中，患者完成体外照射后H+CRT组临床总有效率达到97%，明显高于CRT组，与文献[4-5]报道一致，提示热疗的使用促进了宫颈癌患者肿瘤组织的消退，该疗法与放化疗具有明显的协同效应，具有理想的近期疗效。在随后的生存情况调查中，笔者发现H+CRT组患者中位生存期明显长于CRT组，与文献[6]报道不一致，该文献报道同步放化疗、同步热放化疗治疗中晚期宫颈癌，1，2，3 年累积生存率比较差异无统计学意义。笔者认为放化疗作为癌症的基础治疗手段，对延长癌症患者的生存期确实具有一定效果，在基础放化疗方案上增加热疗虽具有较好的近期疗效，但其对中晚期宫颈癌患者短期累积生存率的影响并不明显，只有延长评估时间才可判断其远期疗效。

免疫失调是肿瘤的主要病理特征之一，在病原的不断刺激下，CD4+T细胞分化成调节性T细胞和效应T细胞两类，介导机体的免疫，同时还调控炎症反应的过程。正常机体Th1/Th2处于动态平衡的状态，两类Th细胞通过刺激分泌不同的细胞因子形成一个庞大的细胞网络，彼此交叉应答又相互制约[7-9]。Th1及其相关细胞因子可对细胞产生毒性而发挥杀伤作用，同时介导细胞免疫应答，当Th1表达上调时，细胞免疫应答处于明显优势，影响了机体的体液免疫应答。Th2及其主要表达的细胞因子通过促进机体抗体的生成而介导体液免疫，当Th2处于优势时，体液免疫较细胞免疫强势，从而抑制了Th1细胞应答，导致肿瘤免疫逃逸。因此当表达优势偏重于Th1或Th2时出现Th1/Th2漂移，Th1/Th2漂移的出现可促发肿瘤细胞逃逸机体免疫的监视，从而导致病情发展恶化[10]。Th1以表达IFN-γ为主，Th2以分泌IL-4为主。本研究结果发现，中晚期宫颈癌患者外周血IFN-γ细胞百分率及IFN-γ蛋白水平均明显低于健康对照组，而IL-4细胞百分率并未发生明显改变，IL-4水平明显升高，Th1/Th2比值明显下调，提示中晚期宫颈癌患者外周血中由Th1介导的细胞免疫受到明显抑制，Th1表达的偏移可能是宫颈癌患者机体肿瘤细胞逃逸免疫抑制的机制之一。而有学者发现宫颈癌组织中Th1表达变化不明显，Th1/Th2比值并未发生改变，这说明肿瘤逃逸现象在外周血表现得更为活跃，外周血发挥的抗肿瘤免疫作用明显较微弱[6]。本研究结果还显示，治疗后CRT组、H+CRT组IFN-γ细胞百分率及IFN-γ蛋白水平均有所上调，Th1/Th2比值均有改善，其中H+CRT组改善更为明显，因此认为热疗的介入可明显促使Th1/Th2的表达平衡。

传统认为CD4+T细胞可分为Th1、Th2以及Treg，随着研究的深入，Th17作为新的CD4+T细胞亚群而被发现，因高分泌IL-17而得名。IL-17属于促炎效应极强的因子，其与受体结合后可以作用于多种细胞类型来诱导产生细胞因子，发挥着促进炎症发展、免疫应答等多种功能。本研究发现，中晚期宫颈癌患者Th17细胞百分率及IL-17水平均明显高于健康对照组，治疗后均明显降低，且H+CRT组降低更为明显。说明热疗通过活化外周血Th17细胞减轻了机体由于放化疗等引起的过度应激反应，避免了机体自身反应性T淋巴细胞功能亢进。

近几年国内外研究均显示Treg细胞拥有免疫无能及免疫抑制的效应，其不但介导免疫过程，还全程参与肿瘤免疫耐受的调节，Treg细胞与介导炎症反应的Th17均来源于原始T细胞，两者之间即相互牵制又相互依赖，正常情况下，Th17/Treg的动态平衡是机体免疫环境稳定的前提。而Treg细胞的生长发育有赖于FoxP3蛋白的调节。本研究结果发现，中晚期宫颈癌患者CD25+Foxp3+细胞百分率及FoxP3蛋白表达水平均明显升高，Th17/Treg比值均明显降低，治疗后均明显改善，且H+CRT组改善更明显。提示肿瘤发生后随着Th17分化的明显增强，破坏了Th17/Treg动态平衡，为了维持这一平衡，癌症患者体内的Treg应激性增多，而Treg又可诱导肿瘤的免疫耐受，导致肿瘤不断生长。放化疗尤其增加热疗的介入，宫颈癌患者体内Th17/Treg动态平衡得以恢复，抑制了肿瘤微环境中Th17及Treg的含量，进一步抑制了肿瘤的生长，因此认为Th17/Treg可准确评估机体对肿瘤的免疫活性强弱，而热疗可通过稳定Th17/Treg动态平衡达到抗肿瘤效应。

综上所述，Th1、Th2、Th17、Treg细胞均与宫颈癌患者存在密切的关联，热疗可以有效调节CD4+T细胞群的动态平衡，从而实现清除肿瘤细胞的目的。

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Effect of synchronization of thermotherapy and chemoradiotherapy on cervical cancer in middle and late stage and CD4+T cells dysequilibrium

YANG Xiaojie1, FAN Lingxia1, SONG Junxia1, XIE Ya2

(1. The Central Hospital of Jiaozuo Coal Group, Jiaozuo 454000, Henan, China; 2.The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan, China)

Objective It is to observe the clinical curative effect of synchronization of thermotherapy and chemoradiotherapy on cervical cancer in middle and late stage and CD4+T cells dysequilibrium. Methods 200 patients with cervical cancer in middle and late stage were randomly divided into the CRT group and H+CRT group, the CRT group was treated with traditional chemoradiotherapy, H+CRT group were treated with abdominopelvic cavity deep local thermotherapy based on the therapeutic schedule of the CRT patients. The clinical curative effect and survival time between the two groups were compared. 100 women given physical examination were set as the control group. The levels of peripheral blood Th1, Th2, Th17 and Treg cells, the concentration of the relevant cytokines were detected in the three groups. Results The total effective rate was higher while survival time was longer in H+CRT group than that in CRT group (P<0.05). Compared with control group, Th1 cells percentage and Th17/Treg and IFN-γlevel in peripheral blood were significantly lower in patients with cervical cancer, although the difference in Th2 cell percentage was not significant (P>0.05), but Th1/Th2 was lower than that in control group(P<0.05), Th1/Th2 drift could be found. After the intervention, percentage of Th1, Th2, Th17 and Treg cells recovered, the recovery was more obvious in H+CRT group than that in CRT group.Conclusion CD4+T cells dysequilibrium appears in the patients with middle and late stage cervical cancer, thermotherapy can achieve the purpose of anti-tumor by correcting the level of CD4+T cells.

cervical cancer; middle and late stage; CD4+T cells; thermotherapy

杨晓杰，女，主治医师，从事妇产科疾病研究工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.26.007

R737.33

A

1008-8849(2016)26-2871-05

2016-04-25