多聚赖氨酸对同种异体骨的细胞亲和性影响的实验研究

笪　虎,焦　峰



·论著·

多聚赖氨酸对同种异体骨的细胞亲和性影响的实验研究

笪虎,焦峰

目的研究兔同种异体骨经多聚赖氨酸表面改性后，对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)亲和性的变化。方法采取冻干法，将多聚赖氨酸覆盖在同种异体骨的微孔表面，对其进行表面改性。表面改性后的同种异体骨设定在实验组，表面未改性的设定在对照组，BMSCs分别种植于两组同种异体骨的微孔表面。采用扫描电镜观察、噻唑蓝(MTT)法检测BMSCs在同种异体骨微孔表面贴附、增殖情况，同时检测两组经诱导培养后的细胞表达的碱性磷酸酶(ALP)的活性，并对两组的结果进行比较。结果实验组中BMSCs在同种异体骨微孔表面贴附、增殖以及向成骨细胞分化的情况明显优于对照组(P<0.05)。结论同种异体骨经多聚赖氨酸表面改性后，显著提升了BMSCs的亲和性。

同种异体骨； 多聚赖氨酸； 骨髓间充质干细胞； 兔； 表面改性

同种异体骨是骨科最常用的骨缺损填充材料，它在受体内主要起骨传导的作用，即为受体的骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞等提供生长的平台或载体[1-2]。但是，目前临床上所用的同种异体骨均未经过表面修饰剂的修饰，其对细胞的亲和性(即对细胞的富集能力)仍不够理想，不能完全满足临床的需要[3]。主要表现为：骨缺损区在植入同种异体骨后，常出现细胞难以大量贴附、增殖与分化的现象，导致其不能充分发挥骨传导的功能，从而引起骨缺损区愈合延迟甚至不愈合[4-5]。近十年来，许多学者利用多聚赖氨酸对壳聚糖、珊瑚羟基磷灰石、羟乙基乙酸等组织工程支架进行表面改性，均显著地提高了支架对细胞的亲和力[6-8]。为增加同种异体骨对细胞的亲和力，本研究采取冻干法，将多聚赖氨酸覆盖在同种异体骨的微孔表面，对其进行表面改性。本研究通过评价同种异体骨经多聚赖氨酸表面改性后，其对细胞亲和力的变化，旨在明确多聚赖氨酸对同种异体骨进行表面改性的意义。

材料与方法

1材料

新西兰大白兔由第四军医大学实验动物中心提供；兔同种异体骨由第四军医大学西京骨科医院骨库提供；左旋多聚赖氨酸(相对分子量为15～30万，Sigma，美国)；DMEM培养基、D-Hank’s液、TGF-β2(Gibico，美国)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；戊巴比妥(军事医学科学院)；胰蛋白酶、地塞米松、L-抗坏血酸(Sigma，美国)；ITS(其中含有牛胰岛素、人转铁蛋白、亚硒酸钠，Sigma，美国)；丙酮酸钠、碱性磷酸酶(ALP)活性测定试剂盒(上海化学试剂集团)；β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)；50mL一次性塑料培养瓶(Coster，美国)；CO2恒温培养箱(Hereus，德国)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；倒置相差显微镜(Zeiss，德国)；扫描电子显微镜(Hitachi，日本)；冷冻干燥机(Alpha 2-4,Chaist,德国)；酶联免疫检测仪(Sunrise,瑞士)。

2方法

2.1同种异体骨的表面改性将兔椎体松质骨来源的同种异体骨切割成边长为3mm的立方体，置于3%的多聚赖氨酸溶液内，振荡2h，使溶液充分浸透入同种异体骨的微孔表面。然后取出置于清洁玻片上，-20℃下预冷2h、-80℃下冷冻1h，转移至冷冻干燥机中干燥24h，即获得微孔表面经多聚赖氨酸改性后的同种异体骨。20kGy60Co辐照灭菌后，4℃条件下密封保存、备用。经表面改性的同种异体骨设定为实验组，未经表面改性的为对照组。

2.2兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的提取和培养肌注麻醉新西兰大白兔后，于兔一侧股骨大粗隆处备皮，消毒、铺无菌巾。持腰穿针刺入股骨大粗隆内，以5mL无菌注射器抽取1ml骨髓(注射器内预留肝素0.1mL以抗凝)。将骨髓移入50mL培养瓶中，其中预先装有含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基。接着置于37℃、5% CO2恒温培养箱内培养，以全骨髓贴壁法培养提纯BMSCs。3d后进行首次全量换液，去除未贴壁的细胞。此后2d半量换液一次，待细胞达80%～90%融合时消化传代。

2.3BMSCs种植于同种异体骨的微孔内将生长融合的第3代BMSCs消化、重悬，置于向成骨方向诱导的培养基(含10-8M地塞米松、50mg/L L-抗坏血酸、10mM β-甘油磷酸钠和10%胎牛血清的高糖DMEM)内，调整细胞密度为1×106/mL。无菌12孔细胞培养板的每孔内放置一粒同种异体骨，用20μL移液器吸取10μL细胞悬液缓慢滴加至支架表面，待其完全渗透进入支架后再继续滴加，最终接种细胞数量控制在2×104个/块。置于细胞培养箱中孵育2～4h后，添加向成骨诱导的培养基，此后2d半量换液1次。

2.4扫描电镜观察细胞在两组同种异体骨内贴附与增殖情况于培养第 2、8和14天，使用2.5%的戊二醛、1%锇酸先后固定同种异体骨，然后乙醇依次梯度脱水。乙腈依次置换乙醇后，在真空条件下进行干燥处理。标本粘贴在金属托上后，在同种异体骨与细胞表面喷金。标本放置于扫描电镜内，观察细胞在同种异体骨微孔表面贴附与增殖情况。

2.5噻唑蓝(MTT)法检测两组同种异体骨内细胞的数量于培养、诱导第 2、4、6、8、10、12、14和16天，利用MTT法分别检测细胞在实验组和对照组同种异体骨微孔上的贴附与增殖情况。每个时间点两组各取8个标本，然后分别用磷酸缓冲溶液(PBS)轻柔地冲洗3遍，除去未能有效贴附的细胞。先加入MTT溶液，置于培养箱内继续培养4h后，吸弃12孔细胞培养板孔内上清液。再加入二甲基亚砜(DMSO)震荡10min，使甲臢结晶充分溶解，每孔吸取150μL液体移入另一96孔细胞培养板中，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。以时间为横轴，光吸收值(A)为纵轴绘制细胞生长曲线。

2.6同种异体骨内贴附细胞表达的ALP的活性测定于培养、诱导第4、8、12和16天，每个时间点两组各取8个标本。弃去两组培养液，D-Hank’s液冲洗3次，根据ALP活性测定试剂盒逐步加入试剂。用酶标仪在520nm波长处测定吸光度A值，即代表细胞ALP的活性。

2.7统计学分析

结　果

1细胞在两组同种异体骨表面贴附、增殖情况的扫描电镜观察

BMSCs植于两组同种异体骨后的第2、8和14天，利用扫描电镜观察细胞的贴附、增殖的情况(图1)。培养后第2天，细胞在两组松质异体骨微孔的表面均完全伸展开，可见长长的伪足，但实验组的细胞密度是对照组的2～3倍，见图1a、b；培养后第8天，两组细胞密度均增加，而实验组增加得更多，两组细胞密度相差显著，见图1c、d；培养后第14天，实验组细胞近于铺整个满微孔表面，细胞膜之间发生接触，数量难于继续大幅增加，而对照组细胞密度仍明显小于实验组，细胞膜之间无明显接触现象，见图1e、f。

2细胞在两组同种异体骨内增殖的情况

MTT实验结果(图2)显示：从培养的第2～14天，细胞在两组同种异体骨内的数量均持续增加，细胞生长曲线呈抛物线形。接种、培养后即迅速增殖，10d后增殖速度减慢，14d后进入平台期。每个时间点上实验组内细胞的数量均明显高于对照组，两组差异显著(P<0.05)。

图1　细胞在实验组和对照组同种异体骨表面贴附与增殖情况的扫描电镜观察。

图2　BMSCs在两组同种异体骨微孔表面贴附与增殖情况的结果分析，数据采用±s表示(*P<0.05；n=8)

3BMSCs在两组同种异体骨内培养、诱导的不同时段的ALP活性

ALP活性的实验结果(表1)显示：实验组和空白对照组细胞经过成骨诱导液培养后，ALP的活性随时间延长而增大。分别在4、8d时，实验组平均值稍高于对照组，但两组结果无显著差异(P>0.05)；分别在12、16d时，实验组ALP活性明显大于对照组，且两组差异显著(P<0.05)。

表1　BMSCs在两组同种异体骨内培养不同时段表达的ALP活性±s，n=8)

讨　论

支架材料的微孔表面能与细胞贴附分子以及某些生长因子受体相互作用，以便于种子细胞的贴附、扩增和分化，从而给种子细胞提供一个生长的平台[9]。将支架材料与生物分子结合以对支架材料进行表面改性，是改善骨组织工程支架性能的重要策略之一[10]。支架材料表面改性的主要目的是提高支架对细胞的亲和性，优化其骨传导能力。随着骨组织工程的迅猛发展，支架表面改性成为目前研究的热点，已有许多学者对人工合成支架材料进行表面改性，并报道获得了一定的成果[3]。但目前被广泛运用于临床的同种异体骨均未经表面改性，对细胞的亲和性还不够理想，影响了骨缺损的修复进程。因此，对同种异体骨进行表面改性，提高其对细胞的亲和力显得十分必要。

多聚赖氨酸是一种由多个赖氨酸片断经共价键及范德华力等聚合而成的有机物[6]，被广泛应用于细胞培养瓶(板)的表面处理[11-13]。许多实验证明：多聚赖氨酸能促进细胞在培养瓶(板)表面的贴附、生长及增殖[11，13-14]。受此启发，本研究将多聚赖氨酸覆盖在同种异体骨的微孔表面，对其进行表面改性处理，期望在微孔表面构建一个有利于细胞贴附、增殖的局部微环境，促进种子细胞的贴附、增殖和分化。本研究旨在通过体外实验，了解同种异体骨经多聚赖氨酸表面改性后，对种子细胞亲和力改变的情况。

本实验设定经表面改性的同种异体骨为实验组，未经表面改性的为对照组。在相同条件下， BMSCs被种植于两组同种异体骨上，以成骨诱导培养基将其向成骨方向进行诱导、培养。于种植、培养后的多个时间点，分别采用扫描电镜观察、MTT法检测BMSCs在两组同种异体骨微孔上贴附、生长、增殖情况，同时检测两组经诱导培养后的细胞表达的ALP的活性，并进行对比。结果显示：BMSCs在实验组同种异体骨内贴附、增殖的数目显著多于对照组(P<0.05)，向成骨细胞分化的情况显著优于对照组(P<0.05)，即多聚赖氨酸能促进BMSCs在同种异体骨的微孔表面进行贴附、增殖和分化。

分析多聚赖氨酸对同种异体骨表面改性的作用机制，可能是：(1)多聚赖氨酸是一种多价阳离子聚合物，附着在同种异体骨微孔表面后，改变了微孔表面电荷状态。能通过静电吸引等作用，避免细胞聚集成球状，使细胞在材料上贴附并铺展为单层，明显提高了三维立体条件下的细胞贴附效率[15]。(2)多聚赖氨酸与细胞磷脂双层有直接的连接作用，可增加细胞在同种异体骨微孔表面的贴附[16]。(3)多聚赖氨酸所含的胺基、羟基等，能吸附溶液和血清中层粘蛋白、糖胺聚糖和纤维粘连蛋白等，改善异体骨微孔表面活性，增强亲水性，可促进细胞的贴附[17-18]。(4)通过其残基所带的阳离子，能与细胞表面的特异阴离子发生交联作用，以促进细胞的贴附；同时，通过稳定细胞外基质来促进细胞的生长和分化[19]。

需指出的是：采取冻干法利用多聚赖氨酸对同种异体骨进行表面改性，此技术的方法与步骤较简单，易于掌握与操作，成本较低，绝大多数科研院所均能实施。但是，本研究仅是体外实验，多聚赖氨酸在体内对人体是否有害，还要进行大样本量的动物体内实验才能证实。

本实验表明：多聚赖氨酸可作为同种异体骨表面改性的涂层材料，能明显提高同种异体骨对细胞的亲和性。本研究为组织工程骨的成功构建提供一种新的选择，为提高临床使用同种异体骨治疗骨缺损的效果提供了理论基础，将会有较广阔的临床应用前景。

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(本文编辑： 郭卫)

Effect of polylysine on the affinity to the cells of the allogeneic bone

DAHu，JIAOFeng

(The 82nd Hospital of PLA,Huai’an223001,China)

ObjectiveTo investigate the change of the affinity of allogeneic bone to BMSCs of the rabbit after surface modification with polylysine. MethodsThe surface modification of the allogeneic bone was processed by the polylysine with lyophilization methods. The allogeneic bones whose surface was modificated were taken as the experimental group,and the others without modification were taken as the control group. The BMSCs was implanted onto the surface of the micropores in the bone allografts. The attachment and proliferation of BMSCs on the surface of the micropores in the bone allografts were observed with SEM and detected with MTT methods,and the activity of the ALP expressed by the osteoblast-induced BMSCs was also detected. Then,the results were compared. ResultsThe attachment,proliferation and osteoblast-differentiation of BMSCs in the experimental group were much superior than those in the control group(P<0.05). ConclusionThe affinity of the bone allografts to BMSCs can be significantly promoted after surface modification with polylysine.

allogeneic bone; polylysine; BMSCs; rabbits; surface modification

1009-4237(2016)05-0291-04

淮安市科技计划项目资助(HAS2013034)

223001 江苏 淮安，解放军第八二医院

焦峰，E-mail:923521468@qq.com

R 318.08

A

10.3969/j.issn.1009-4237.2016.05.010

2015-01-19；

2015-03-24)