应用通用荧光引物筛选裸鼹鼠微卫星位点方法的建立

林丽芳， 李 莉， 肖 邦， 程继帅， 杨文静， 丛 薇， 赵善民， 汤 球， 崔淑芳（. 第二军医大学实验动物中心， 上海 00433； . 第二军医大学教学保障处， 上海 00433）

应用通用荧光引物筛选裸鼹鼠微卫星位点方法的建立

林丽芳1， 李 莉2， 肖 邦1， 程继帅1， 杨文静1， 丛 薇1， 赵善民1， 汤 球1， 崔淑芳1
（1. 第二军医大学实验动物中心， 上海 200433； 2. 第二军医大学教学保障处， 上海 200433）

目的 建立使用通用荧光引物分步PCR法筛选裸鼹鼠微卫星位点的方法。方法 在特异性引物F链的5’端连接通用引物，先以特异引物R链和加长引物F链进行PCR，再加入通用荧光引物进行第二步PCR，最后使用琼脂糖电泳和毛细管电泳检测扩增产物，同时以传统的荧光引物PCR为对照。结果 琼脂糖电泳结果显示，通用荧光引物PCR产生的目的片段清晰，引物特异性强，目的片段多态性与传统PCR产生的多态性一致，且片段大小均比传统PCR产生的目的片段大15 bp左右，与预期一致。毛细管电泳结果也显示，通用引物PCR结果检测的等位基因数与传统荧光引物PCR方法产生的数量完全一致，无杂带，扩增效率高，具有较强的可操作性。结论 使用通用荧光引物分步PCR法结果可应用于裸鼹鼠基因组大量微卫星位点的筛选。

裸鼹鼠； 微卫星位点筛选； 通用荧光引物； PCR

裸鼹鼠作为一种新型实验动物， 近年来得到国际上广泛重视［1-5］， 但对其遗传学研究目前报道较少。遗传背景清晰是裸鼹鼠实验动物化的重要前提，因此，裸鼹鼠的遗传学研究迫在眉睫，尤其是分子遗传学研究。但至今为止报道［6］的关于裸鼹鼠的微卫星位点仅12个，远远不能满足裸鼹鼠的遗传多态性鉴定需要。因此近年来本实验室在建立裸鼹鼠封闭群并进行一系列生物学特性研究的基础上［7-10］，进一步筛选裸鼹鼠高度多态性微卫星位点，以期建立裸鼹鼠的遗传学检测标准，为裸鼹鼠的遗传学检测奠定基础。

微卫星位点检测方法目前有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳。其中毛细管电泳最为灵敏， 且可实现高通量检测， 操作过程相对简单， 结果可靠， 是判断的最终标准。但是筛选高度多态性微卫星位点以及鉴别个体的基因多态性过程中， 需要标记每对荧光引物，产生巨额的费用。此外，若位点的多态性低不具代表性，该引物将被淘汰，造成一定的浪费。因此， Schuelke［11］采用通用荧光引物PCR的方法解决了基因分型的问题。

通用引物PCR的原理是: 在特异性引物F链的5’端加一段通用序列， 经过多个PCR循环后， 目的片段将带有通用序列及其互补序列。此时， 再将产物与通用荧光引物进行PCR反应，终产物片段将标记上荧光， 因此可以通过该荧光信号进行PCR检测。该方法很大程度上节省了实验费用，但已报道的研究主要针对物种的基因分型，未涉及通用荧光引物在微卫星位点筛选的应用。本研究在应用通用荧光引物的基础上，调整PCR循环， 使用分步PCR方法，可操作性强，且具有较高的经济效益，适用于裸鼹鼠的微卫星位点筛选。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年裸鼹鼠由第二军医大学实验动物中心繁殖。

1.2 仪器及试剂

主要仪器有毛细管电泳仪、PCR仪、高速低温离心机、恒温干燥箱、分光光度计等。主要试剂有基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN，美国），PCR试剂盒（TAKARA，大连宝生物），毛细管检测试剂盒（Beckman，美国），DL2000 DNA Marker、琼脂糖等均购自上海生工生物公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及基因组DNA提取 随机从裸鼹鼠群落中抽样10只裸鼹鼠， 雌性各半， 年龄为7～10月龄， 各剪取约1 cm长尾尖部， 使用基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取， 作为下一步的PCR模板。

1.3.2 引物设计 引物由通用引物和特异性引物两部分构成。通用引物U为: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'（5'标记FAM荧光）； 特异性引物则通过NCBI的Genbank，随机查找具有多重复核苷酸序列的位点，以重复核苷酸序列为核心区域，使用PRIMER5软件进行引物设计， 在特异F链引物5'端连接通用引物U: U-F（无需标记荧光）。同时对照组为传统PCR，引物为特异性引物F链和R链。所有引物委托上海生工生物公司合成（表 1）。

1.3.3 通用荧光引物PCR检测 本实验使用两步的PCR进行检测。第一步将裸鼹鼠基因组DNA作为PCR模板， 以特异性引物R链和U-F链为引物进行PCR。PCR反应体系为25 μL， 各组分的终浓度为: 0.05 U Taq 多聚酶/μL， 250 μmol/L dNTP， 50 mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 特异性引物（R链，U-F链）0.2 μmol/L， 0.5 μL DNA模板（30～60 ng）。PCR反应程序: 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 退火温度30 s， 72 ℃ 30 s，35个循环； 72 ℃ 10 min。第二步，PCR结束后在PCR反应液中加入0.4 μL的通用引物U（10 μmol/L）， 混匀后进行第二步的PCR。PCR反应程序：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃30 s，8个循环； 72 ℃ 10 min。

同时以普通PCR为对照，引物为特异性引物R链和F链。反应体系为25 μL，各组分的终浓度为：0.05 U Taq 多聚酶/μL，250 μmol/L dNTP，50 mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 特异性引物（R链，F链）0.4 μmol/L， 0.5 μL DNA模板（30～60 ng）。PCR反应程序: 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，退火温度30 s，72 ℃ 30 s，35个循环； 72 ℃ 10 min。

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测 本研究将10个基因组DNA样本混合作为PCR模板，分别使用通用引物PCR和传统PCR检测不同位点对应的引物5-7、58-1、57-1、54-2、4-8，终产物分别于3%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，上样量为质量分数10 μL，电泳条件为: 30 min，120 V。

1.3.5 毛细管电泳检测 基于前期的琼脂糖凝胶电泳检测结果，本实验针对裸鼹鼠位点对应的引物3-81，分别以5个不同裸鼹鼠个体的基因组DNA为模板，使用传统荧光引物PCR方法（F链5'端标记FAM荧光）和通用荧光引物PCR法进行位点扩增，PCR产物毛细管电泳检测分析。具体检测步骤为: 将PCR产物稀释10倍，稀释后的PCR产物加入加样板，在每个样中加入上样缓冲液（SLS，甲酰胺）以及分子量内标， 使用毛细管电泳仪（Beckman P/ACEMDQ）进行检测。设定STR方法（温度50 ℃； 进样2.0 kV， 30 s； 电泳5.0 kV， 62 min）进行电泳检测。荧光信号收集完毕后，用CEQ分析软件自动统计分析，并读取峰值大小和峰值位置。

表 1 引物序列

2 结果

2.1 琼脂糖电泳检测结果

以基因组DNA混合样本为模板，以引物5-7、58-1、57-1、54-2、4-8分别进行通用荧光引物PCR和传统PCR。琼脂糖电泳结果显示，通用荧光引物PCR产生的目的片段清晰，条带数量与传统PCR产生的片段数量一致，引物特异性强， 目的片段大小均比传统PCR产生的目的片段大15 bp左右，结果可靠，具有较强的可操作性，该方法可应用于裸鼹鼠基因组大量微卫星位点的筛选（图 1）。

2.2 毛细管电泳检测结果

本实验针对裸鼹鼠位点对应的引物3-81， 分别使用传统荧光引物PCR方法（F链5'端标记FAM荧光）和通用荧光引物PCR法对5个不同裸鼹鼠个体的基因组进行位点扩增后， 毛细管电泳检测。结果显示， 通用引物PCR产生的等位基因数与传统荧光引物PCR方法产生的数量完全一致， 无杂带， 扩增效率较高， 可用于裸鼹鼠微卫星位点的筛选（图2）。

3 讨论

本研究建立的分步通用荧光引物PCR方法从PCR反应体系以及PCR反应程序上都进行了调整，与Schuelke［11］报道的方法比较，更适用于裸鼹鼠的微卫星位点筛选。同时，一条通用荧光引物可用于所有的位点筛选，避免了大量荧光引物的合成，可节约大量费用。

通用荧光引物的设计，决定了该PCR方法的可行性。通用荧光引物设计的原则为: 与裸鼹鼠基因组无同源性、引物长度在15～30 bp范围内、引物自身不形成发夹结构以及二聚体等［12］。本实验引用Schuelke于2000年报道的通用引物［11］，经验证，该通用引物与裸鼹鼠基因组无同源性，适用于裸鼹鼠微卫星位点的筛选。

本实验使用分步的PCR循环，结果比连续的PCR循环更为稳定可靠。本实验先根据特异引物的最佳退火温度进行35个循环的PCR后，再加入通用引物，进行8个循环的扩增。琼脂糖电泳和毛细管电泳结果都与预期一致，结果稳定可靠。Schuelke［11］报道的通用荧光引物PCR方法中，将特异性引物和通用引物置于同一体系，两次的PCR循环连续进行。本研究显示将特异性引物和通用引物置于同一体系检测结果稳定性较差，部分引物的特异性降低，可能是通用引物的退火温度与特异性引物的退火温度较为接近，影响特异性引物的特异性扩增。而裸鼹鼠微卫星位点的筛选由于位点数量多、引物退火温度范围广、引物长度多样性高，对通用荧光引物PCR的体系及PCR程序要求较高。

图 1 不同微卫星位点的通用荧光引物和传统荧光引物PCR的琼脂糖电泳

本研究中琼脂糖电泳及毛细管电泳检测结果均表明，通用荧光引物分步PCR法对微卫星位点多态性的分析结果与传统荧光引物PCR方法一致。理论上，通用引物长为18 bp，因此，通用引物PCR产生的片段大小比传统PCR产生的片段大18 bp。从琼脂糖电泳的结果可见两者产生的片段多态性、条带清晰度一致，前者产生的片段比后者片段大约15 bp，符合预期。而进一步的毛细管电泳结果也显示，两种方法检测同一样本的同一位点，产生的片段多态性一致，通用引物PCR产生的4个等位基因片段比传统PCR产生的片段长度均长16 bp，与预期的18 bp小，可能是PCR过程结束时末端加碱基A所导致或者不同批次检测内标的差异引起，但是不影响对微卫星位点多态性的分析及筛选。

图 2 传统荧光引物和通用荧光引物PCR方法的毛细管电泳

通用荧光引物PCR法节省了大量的实验成本，具有巨大的应用价值。检测成本高是目前制约实验动物微卫星遗传检测方法广泛应用的制约因素之一，其中荧光引物合成费用在检测费用中占很大的比例。因此，通用荧光引物PCR方法的使用将在很大程度上降低检测成本。

本研究建立的通用荧光引物PCR法结果表明，荧光通用引物分步PCR法结果稳定可靠，能真实反映位点的多态性，检测效率高、很大程度地节省了荧光引物的合成费用，具有较高的应用价值，适用于裸鼹鼠多态性微卫星位点的筛选。

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Establishment of PCR Method Using Fluorescence Labeled Universal Primers for Screening Microsatellite Loci in Naked Mole Rat

LIN Li-fang1， LI Li2， XIAO Bang1， CHENG Ji-shuai1， YANG Wen-jing1，CONG Wei1， ZHAO Shan-min1， TANG Qiu1， CUI Shu-fang1
（1. Laboratory Animal Center， 2. Teaching Guarantee Department，Second Military University， Shanghai 200433， China）

Objective Fluorescent labeled universal primers PCR in two-steps was established to screen microsatellite loci of naked mole rat. Methods A fusion of the forward primer and universal primers in 5' end was created. The first PCR was conducted with reverse primers and forward primer extended with universal primers. The second PCR was initiated after the adding of fluorescent labed universal primers. With conventional fluorescent labeled primers PCR as a control， PCR product was detected by agarose gel electrophoresis and capillary electrophoresis. Results Fluorescent labeled universal primer PCR had strong specificity and bands in agarose gel electrophoresis was sharp. Furthermore， the product had high consistent polymorphism with those in traditional PCR， with size being about 15 bp. They were in line with expectations. After analysis of capillary electrophoresis， it also showel equal number of allele with these two different method. As well， this fluorescent labeled universal primer PCR had high amplification efficiency and being specific， operational. Conclusion The fluorescent labed universal primers PCR in two-steps was applicable to screen a high-flux of microsatellite loci in naked mole rat.

Naked mole rat； Screening microsatellite loci； Fluorescent labeled universal primers； PCR

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0076-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.016

2015-12-14

上海市科技发展基金项目（12140900400）与国家科技支撑计划项目（2015BAI09B02）联合资助

林丽芳（1986-）， 女， 助教。E-mail: linlifang2012@126.com

崔淑芳， 教授。E-mail: youngstar_sf@163.com