阿尔茨海默病患者外周血调节性T细胞稳定性的分析

高玉雷 翟建华 刘 斌 柴艳芬

（天津医科大学总医院急诊医学科，天津 300052）

阿尔茨海默病患者外周血调节性T细胞稳定性的分析

高玉雷 翟建华 刘 斌 柴艳芬

（天津医科大学总医院急诊医学科，天津 300052）

目的：探讨阿尔茨海默病(AD)患者外周血调节性T细胞(Tregs)稳定性的特点。方法：分选AD患者外周血Tregs，通过流式细胞仪检测特征性标志物叉头转录因子(Foxp)-3和表面分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4 及膜相关转化性生长因子(TGF)-β的表达水平，通过ELISA检测特征性细胞因子TGF-β和白细胞介素(IL)-10分泌水平，并进一步通过Transwell培养板培养方法，分析AD患者Tregs发挥免疫抑制功能的特点。结果：与对照组比较，AD组患者细微精神状态语言检查(MMSE)评分明显降低(P＜0.01)；AD组外周血Tregs数目、特征性标志物Foxp-3及细胞表面标志物CTLA-4和膜相关TGF-β表达水平均均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；特征性细胞因子TGF-β和IL-10分泌水平均无明显变化(P＞0.05)；经Transwell培养板培养24 h，能够降低AD组Tregs对CD4+CD25-T细胞增殖功能的抑制作用，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：AD能够降低患者外周血Tregs稳定性，其机制主要是降低其以细胞接触途径介导的免疫调节作用。

阿尔茨海默病 调节性T细胞 免疫抑制 稳定性

阿尔茨海默病（AD)主要表现为神经系统β淀粉样变性，慢性神经炎症反应是病情发生发展的主要机制[1]。既往有研究表明，高龄AD晚期患者外周血主要表现为β淀粉样变性特异性T细胞比例升高[2]。近期通过5XFAD小鼠AD模型研究发现，这种特异性T细胞比例的升高与Foxp-3+调节性T细胞（Tregs）比例及稳定性降低有关，增加小鼠体内Tregs比例能够降低神经系统β淀粉样变性的程度以及延缓变性时间，但目前并没有针对AD患者外周血Tregs特点的

探讨[3]。本研究通过检测AD患者外周血Tregs特征性标志物叉头转录因子(forkhead/winged helix transcription factor, Foxp)-3和表面分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(cytotoxic T lymphocyte associated antigen, CTLA)-4及膜相关转化性生长因子(transforming growth factor, TGF)-β表达水平，检测细胞因子TGF-β和IL-10分泌水平，并进一步通过Transwell培养板培养方法，初步探讨AD患者外周血Tregs稳定性的特点。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器 人CD4+CD25+Tregs分选试剂盒(德国Miltenyi公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，RPMI1640培养基和磷酸盐缓冲液(北京索莱宝公司)，红细胞裂解液(天津灏洋生物公司)，人IL-10和TGF-β ELISA试剂盒(上海依科赛公司)，细胞毒性/增殖检测试剂-8(日本Dojindo公司)，异硫氰酸荧光素（FITC）-人-Foxp-3、FITC-人-CTLA-4和APC-人-TGF-β (加拿大eBioscience公司)。CO2恒温培养箱(日本NAPC公司)，光学显微镜和倒置显微镜(日本Olympus公司)，SpectraMR多功能酶标仪(美国DYNEX公司)，细胞分选仪和流式细胞仪(德国Miltenyi公司)。

1.2 研究对象 天津医科大学总医院神经内科2015年1月—2016年1月收治的AD患者（AD组）及无AD表现的患者（对照组）。AD依据美国国立神经病语言障碍卒中研究所AD及相关疾病协会制定的AD诊断标准[4]进行诊断，并采用细微精神状态语言检查(mini-mental state examination, MMSE)量表[5]进行痴呆评分筛选；对照组采用MMSE量表对能够生活自理的患者进行记忆力和智力测定等评分，排除痴呆等AD临床表现。所有研究对象均通过结合询问病史、常规体格检查及近期相关辅助检查等，排除免疫相关疾病及近期服用影响免疫功能药物的患者。对两组研究对象的年龄和性别等因素进行分析，保证研究资料的一致性。本试验均符合医学伦理学标准。

1.3 细胞分离及培养 分别抽取各组患者外周血40 ml，使用红细胞裂解液去除红细胞，人淋巴细胞分离液分离单个核细胞。按照磁珠分选原理分选人 CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T细胞。流式细胞仪检测两种细胞纯度分别约为 96% 和95%，锥虫蓝染色细胞存活率均超过96%，可以进行试验。以抗-人-CD3/CD28为CD4+CD25-T细胞增殖的刺激因子，使用96孔普通培养板和Transwell培养板，CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T细胞共培养细胞比例为1∶1共培养24 h。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 流式细胞仪检测Tregs标志物表达 收集分选后的各组Tregs，离心弃上清液，加入100 μl磷酸盐缓冲液重悬细胞(2×105)，分别加入FITC-人-Foxp-3、FITC-人-CTLA-4和APC-人-TGF-β，设阴性对照管；4 ℃避光孵育30 min，加入磷酸盐缓冲液 2～3 ml离心洗涤2次，弃上清液；重悬细胞，流式细胞仪检测表达率。

1.4.2 多功能酶标仪检测CD4+CD25-T细胞增殖能力 各组Tregs 和 CD4+CD25-T细胞共培养24 h后，各孔吸出 100 μl上清液，并加入10 μl细胞毒性/增殖检测试剂-8，继续培养1～2 h，通过多功能酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值(A450)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件处理各组数据，计量资料以x±s表示，进行单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结 果

2.1 对照组与AD组一般资料分析 两组研究对象的样本数目、性别及年龄分布差异均无统计学意义(P＞0.05)。按照MMSE评分进行痴呆筛查后，AD组评分[(12.321±1.210)分]明显低于对照组[(24.654±1.543)分]，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 对照组与AD组一般资料分析

2.2 对照组与AD组外周血Tregs数目与标志物的特点 AD组外周血Tregs数目[(1.321±0.231)×105/ml]明显低于对照组[(2.300±0.435)×105/ml]，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。与对照组比较，AD患者外周血Tregs特征性标志物Foxp-3[对照组(77.430±4.543)%比AD组(55.654±2.654)%]及细胞表面标志物CTLA-4[对照组(70.543±5.881)%比AD组(51.430±3.439)%]和膜相关TGF-β[对照组(57.057±4.697)%比AD组(47.597±3.836)%]表达水平均降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见图1。

图1 AD对患者外周血Tregs数目(A)与标志物Foxp-3(B)、CTLA-4（C）和膜相关TGF-β(D)的影响

2.3 对照组与AD组外周血Tregs分泌游离细胞因子的特点 分选各组外周血Tregs，体外培养2 4 h后，T r e g s分泌T G F-β的水平[对照组(116.187±14.995)pg/ml比AD组(120.110±11.977)pg/ml]和IL-10的水平[对照组(91.283±8.448)pg/ml比AD组(87.120±13.613) pg/ml]差异均无统计学意义（P＞0.05)。见图2。

图2 AD对患者外周血Tregs分泌游离细胞因子TGF-β（A）和IL-10（B）的影响

2.4 对照组与AD组外周血Tregs免疫抑制功能的特点 分选各组外周血Tregs，分别使用普通培养板和Transwell培养板，体外按照细胞数为1:1的比例与正常CD4+CD25-T细胞共培养，培养24 h后，与单纯培养的正常CD4+CD25-T细胞组(A组，0.717±0.088)比较，其余各组Tregs均能抑制CD4+CD25-T细胞增殖功能(B组0.303±0.081, C组0.603±0.032, D组0.513±0.057和E组0.612±0.054)，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；经普通培养板培养后，AD组患者分选的Tregs对CD4+CD25-T细胞增殖功能的抑制作用（D组）明显弱于对照组患者（B组），差异有显著统计学意义(P＜0.01)；经Transwell培养板培养后，能够进一步降低AD患者外周血Tregs对CD4+CD25-T细胞增殖功能的抑制作用（E组），差异有统计学意义(P＜0.05和(P＜0.01)。见图3。

图3 AD对患者外周血Tregs免疫抑制功能的影响

3 讨 论

大量研究表明，过度的特异性T细胞活化和功能增强所引起的神经系统β淀粉样变性参与AD的发生发展过程，并且与年龄有明显的相关性[1-2]。研究者普遍认为，过度的自身免疫反应能够加重AD的病情，甚至使AD的发生趋于年轻化，给予免疫调节治疗，降低过度的特异性T细胞活化与功能增强能够缓解AD症状以及预防AD的发生[6]。

CD4+CD25+Tregs 以高表达CD25及特征性标志物Foxp-3 为主要特征，具有免疫无反应性和免疫抑制性。根据来源不同，Tregs主要分为胸腺中发育的自然性Tregs(nTregs) 和抗原诱导外周CD4+CD25-T淋巴细胞转化而来的诱导性Treg(iTregs)，后者包括Tregs1/辅助性T细胞3(Tregs1/Th3)，狭义上Tregs指nTregs。尽管CD4+CD25+Tregs在CD4+T淋巴细胞中比例为5%～10%，但其在自身免疫性疾病、严重感染及恶性肿瘤诱导的免疫抑制中扮演着关键性角色[7-9]。

既往研究表明，在AD小鼠模型脑内过表达Tregs膜相关TGF-β可以显著促进小胶质细胞对β淀粉样变性的清除，同时能够缓解特异性T细胞过度活化所引起的神经系统β淀粉样变性[10]。对多发性硬化患者的研究表明，增加外周Tregs分泌TGF-β和IL-10的水平，能够缓解病情的发展，然而对于具有类似发病机制的AD患者的相关研究中，尚未见相关报道[11]。本研究表明，AD组外周血Tregs数目、特征性标志物Foxp-3及细胞表面标志物CTLA-4和膜相关TGF-β表达水平均均降低，而特征性细胞因子TGF-β和IL-10分泌水平均无明显变化。本研究通过对AD患者外周血Tregs变化特点的分析，进一步验证了动物实验的结果，为AD免疫调节治疗提供了有力的依据，为探索AD免疫调节途径提供了线索。

既往徐俊等[12]研究发现，AD患者外周血CD4+CD25+Tregs细胞比例及对T细胞免疫抑制功能明显低于对照组，然而并未进一步分析Tregs发生该变化的具体原因。Tregs主要通过CTLA-4和膜相关TGF-β介导的细胞接触机制和分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子发挥免疫抑制效应，其对效应性T细胞主要表现为，抑制T细胞增殖、促进细胞凋亡以及抑制促炎性细胞因子分泌等[7-9]。AD患者外周主要表现为过度的特异性T细胞活化与功能增强，IL-2和干扰素(IFN)-γ等促炎性细胞因子分泌增加，同时结合既往动物实验表明特异性T细胞比例的升高与Foxp-3+Tregs比例及稳定性降低有关，我们推测AD能够降低患者外周血Tregs稳定性[1-3]。我们进一步的共培养结果也初步表明AD能够降低患者Tregs对正常CD4+CD25-T细胞的免疫抑制作用，Transwell细胞培养板的培养结果进一步表明，AD主要是降低了以CTLA-4和膜相关TGF-β介导的细胞接触机制为主的免疫调节作用。

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Analysis of the stability of regulatory T cells in peripheral blood of patients with Alzheimer's disease

Gao Yulei*, Zhai Jianhua, Liu Bin, Chai Yanfen.
*Emergency Department, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

Chai Yanfen (E-mail: chaiyanfen2012@126.com)

Objective: To investigate the stability of regulatory T cells (Tregs) in peripheral blood of patients with Alzheimer's disease (AD). Methods: The peripheral blood Tregs were isolated from AD patients. Flow cytometry was performed to detect the expressions of forkhead/winged helix transcription factor-3 (Foxp-3), the surface molecular cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4) and membrane associated transforming growth factor-β (TGF-β); ELISA was employed to determine the secretion levels of TGF-β and interleukin-10 (IL-10); and furthermore, Transwell culture plate was used to initially identify the immunosuppressive function of Tregs in AD patients. Results: Compared with the control group, the mini-mental state examination (MMSE) score of AD group was significantly lower (P＜0.01). The Tregs number, the expression levels of Foxp-3, CTLA-4 and membrane associated TGF-β were significantly lower in AD group than in control group (P＜ 0.05 or P＜0.01), but there were no obvious changes in the secretion levels of TGF-β and IL-10 (P＞0.05). The immunosuppressive function of Tregs to CD4+CD25- T cells was reduced in AD patients after Transwell culture for 24 hours (P＜0.05). Conclusions: AD can decrease the stability of Tregs in peripheral blood of patients, the mechanism might mainly be the decrease of immunoregulation mediated by cell contact pathway.

Alzheimer's disease; Regulatory T cells; Immunosuppression; Stability

2016-07-14)

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 03. 006

天津医科大学总医院青年孵育基金 (ZYYFY2015020)；北京协和医学基金会“睿E（睿意）急诊医学研究专项基金”(201617)

柴艳芬，主任医师（E-mail：chaiyanfen2012@126.com）