三种马源病原体三重实时荧光定量PCR检测方法的建立

王 艳，张小文，王 政，邱 璐

（1. 上海出入境检验检疫局，上海 200135；2. 山东出入境检验检疫局食品农产品检测中心，青岛 266002；3. 上海市浦东新区农产品安全检测中心，上海 201202）

·研究论文·

三种马源病原体三重实时荧光定量PCR检测方法的建立

王 艳1，张小文2，王 政3，邱 璐1

（1. 上海出入境检验检疫局，上海 200135；2. 山东出入境检验检疫局食品农产品检测中心，青岛 266002；3. 上海市浦东新区农产品安全检测中心，上海 201202）

通过对GenBank中马鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei）、亨德拉病毒（Hendra virus，Hev）和西尼罗热病毒（West nile virus，WNV）的主要基因进行分析比较，分别设计合成了引物和TaqMan 荧光探针，对反应条件和试剂浓度进行优化，建立了能同时检测这3种病原的三重实时荧光定量PCR方法。本研究建立的三重荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性和重复性，适合于大批量样品的检测，可广泛用于出入境马匹这3种病原体的检疫。

马鼻疽伯克霍尔德氏菌；西尼罗热病毒；亨德拉病毒；实时荧光定量PCR

西尼罗病毒（West nile virus，WNV）属于黄病毒科、黄病毒属，主要通过蚊媒传播，1937年首次被分离［1，2］。WNV被认为在蚊-鸟-蚊的传播循环过程中增殖，多数种类的鸟类和蚊类都支持病毒的复制，而且大部分鸟类在感染后并不出现明显的症状［3，4］。人和马被认为是WNV的终端宿主。目前报道的WNV爆发都源自WNV的I型病毒。哺乳动物感染WNV后可出现不同程度和不同症状的临床表现，严重的可影响神经系统，引起西尼罗脑炎。

亨德拉病毒（Hendra virus，HeV）是一种新型人畜共患病病毒，主要感染人和马。HeV感染首次暴发于1994年澳大利亚昆士兰州布里斯班郊区的亨德拉镇，14匹赛马出现严重的急性呼吸道疾病，最终全部死亡，并有2人感染死亡。1994～2008年，昆士兰州其他地方也出现该病，每次仅有1～2匹马出现急性死亡。在人感染致死的病例中，这些人在治疗、护理和剖检马匹时，都与病重、垂死或死亡马匹的分泌物或组织有过直接接触，分别为驯马师、饲养员、兽医和农民［5，6］。

马鼻疽是由鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei）引起的一种人畜共患传染病，主要流行于马属动物中，虎、狮、狗等肉食动物也可因采食患畜的肉和内脏而被感染。马鼻疽通常呈慢性经过，可存活几年，鼻腔结节可造成鼻腔流出粘稠的黄色分泌物，肺脏结节则可伴有进行性衰竭、发热、咳嗽和呼吸困难等。驴、骡发生鼻疽通常呈急性经过，出现高热和呼吸道症状。本病的特征是在鼻腔、咽喉头、气管或皮肤形成特征性鼻疽结节、溃疡或星状瘢痕，在肺脏、淋巴结及其他实质脏器中形成鼻疽结节。2012年4月2日，巴西官方兽医部门在动物移动控制监测中发现了马鼻疽疫情，我国将其列为二类动物疫病［7，8］。鼻疽是一种复杂的传染病，很早以前就在世界各国广泛流行，而且大多数病畜不表现明显的临床症状，潜在的危害极大。

本研究利用Taqman荧光定量PCR技术探索可同时检测3种马病病原的检测方法，从而为进出境马匹的检疫提供技术保障。

1　材料和方法

1.1材料和试剂 Trizol 购自Invitrogen公司；DNA抽提试剂盒、Taq Plus DNA 多聚酶和质粒小提试剂盒购自北京天根生物技术公司；AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs均购自TaKaRa公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）购自上海生工生物技术有限公司；异丙醇、无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；ABI7500 Fast Real-time PCR仪购自美国ABI公司。

1.2方法

1.2.13种马源病原体基因序列的比对和合成 根据GenBank中登录的鼻疽伯克霍尔德氏菌、西尼罗病毒、亨德拉病毒的基因序列（登录号分别为CP000010、AY646354.1、NC_001906），进行全基因合成并克隆于质粒载体上，制备成标准品。对应的3种参考品分别命名为B125、W178、H150。

1.2.2引物及探针的设计与合成 参考相关文献报道及序列比对分析结果，设计1对引物及相应的探针（表1）。引物和探针分别由上海翰宇生物科技有限公司和Lifetech合成。

表1　三重实时荧光定量PCR引物与探针Table 1 The primer pairs and Taqman probes in the triple real-time qPCR

1.2.3三重荧光定量PCR方法的建立

1.2.3.1反应条件的优化和标准曲线的建立 先建立并优化单个靶基因检测体系，在此基础上，逐步改变引物与探针的浓度（采用矩阵法）以达到最佳的扩增效率，获得良好的荧光曲线，选择扩增效果最佳的方法进行下一步试验。使用重组质粒作为标准品制作标准曲线。标准品进行10倍稀释，对应浓度为10～105copies/μL，作为模板进行Taqman模式的三重荧光定量PCR试验。其中每个标准品稀释度3个重复。以Cq值为y轴，标准品的稀释度为x轴制作标准曲线。计算标准曲线的斜率和反应相关系数。

1.2.3.2特异性试验 利用建立的三重荧光定量检测方法，对实验室保存的其他马病阳性对照（马病毒性动脉炎病毒、马鼻肺炎病毒、马流感病毒、马焦虫抗原、马媾疫抗原）进行检测，进一步确定三重实时荧光PCR方法的特异性。

1.2.3.3敏感性试验 将人工合成的西尼罗河热病毒、亨德拉病毒和鼻疽伯克霍尔德氏的相关基因所在的质粒作为模板，并对其进行10倍梯度稀释，使其浓度分别为100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/ μL。在相同条件下对不同浓度的模板量进行荧光定量PCR，观察并分析结果。

1.2.3.4重复性试验 分别对这3种病原体的三重荧光定量PCR进行组间及组内的重复性试验。组间试验为分别为1个月、2个月和3个月从同一管样品中取出模板进行Taqman模式的三重荧光定量PCR，组内试验是每次每个样品进行3个重复，观察并分析结果。

2　结果

2.1重组质粒的浓度测定 3种参考品干粉每管加入100 μL纯化水，采用UV spectrophotometer Q3000测定浓度和纯度，结果见表2。

表2　参考质粒的浓度测定Table 2 The concentration of the reference plasmids

2.3反应条件的优化及标准曲线的建立 对三重荧光定量PCR各条件进行优化后，最终确定反应体系如下：TaqMan Mixture（2×）12.5 μL、WF/WR 0.15μL、HF/HR 0.2 μL、BF/R 0.1 μL、WP1/2 0.08μL、BP 0.05 μL、HP 0.08 μL、模板5 μL，用灭菌ddH2O补足至25 μL。体系中所用引物和探针的浓度均配成10 pmol/mL。95℃预变性10 min；95℃变性25 s，60℃退火并延伸32 s，扩增45个循环；在60℃结束开始收集荧光信号，全部扩增检测在60 min内完成。

重组质粒标准品在浓度10～105copies/μL间均能检测出荧光信号，扩增曲线圆滑平整，且标准曲线均具有良好的线性关系，R值均在0.99以上。三重荧光定量PCR对3种标准品的检测结果如图1、2、3。

图1　检测体系对W178参考品的检测扩增曲线Fig. 1 The standard curve of Real-time qPCR for W178

图2　检测体系对H150参考品的检测扩增曲线Fig. 2 The standard curve of Real-time qPCR for H150

图3　检测体系对B125参考品的检测扩增曲线Fig. 3 The standard curve of Real-time qPCR for B125

2.4cut-off值的初步确定 采用检测体系针对阴性对照（纯化水）进行40次重复检测，设定荧光阈值为1万并观察4个检测通道的Ct值情况，按照非特异性反应产生的最小Ct值作为检测试剂初步的cut-off值（图4）。检测结果，初步将Fam、Rox和Vic的通道的Cut-off值确定为38、37.5和37。

图4　针对阴性对照40次重复检测的扩增结果Fig. 4 The repeatability test of the triple Real-time qPCR for negative controls

2.5特异性试验 所建立的三重荧光定量PCR体系对这3种病原都能检测出各自的扩增曲线，对其他对照病毒、细菌均未出现扩增曲线（图5），判为阴性，说明该检测方法具有良好的特异性。

图5　三重荧光定量PCR特异性试验结果Fig. 5 The amplication curves of the triple Real-time qPCR in specifi city test

2.6敏感性试验 经检测，3种重组质粒在10 copies/ μL时仍能检测出荧光信号值（图6），说明建立的三重荧光定量PCR具有较高的敏感性。

2.7重复性试验 取105、104、103、102、10 copies/ μL 3组不同浓度的标准品质粒，每组做3次重复检测。对结果进行统计学分析，结果显示变异系数均小于3%，重复性较好。

3　讨论

病毒的分离是病毒检测的最基本方法，但存在样本选取问题、耗时等缺陷，特别不利于快速检验筛查工作。血清学抗体检验是临床诊断的主要依据，却存在与其他相近病毒属，如日本脑炎病毒、登革病毒或圣路易斯脑炎病毒、尼帕病毒交叉反应的问题。近年来发展的核酸PCR检测技术越来越受到重视，它耗时短，操作简便，几乎适用于所有的样本，特别是实时荧光PCR检测方法，准确率更高，耗时更短，特别适用于复杂对象样本的快速筛查。

本研究建立的荧光定量检测方法，阳性样品和其他样品的荧光信号曲线分离显著，阳性样品扩增曲线典型，证明建立的方法有较好的特异性。同时经多次灵敏度对比试验，证实该实时荧光PCR与常规的方法相比，具有良好的相关性。结果表明本研究建立的实时荧光PCR方法，反应所需时间短，特异性较好，而且在封闭的系统中操作，减少了交叉污染和操作人员感染的机会，特别适用于高通量的监测工作。

图6　三重荧光定量PCR检测的敏感性试验Fig. 6 The sensitivity results of the triple Real-time qPCR

口岸检验检疫工作所接触的样本种类繁多，如人类血清或组织样本、活动物血清活组织样本、动物产品样本、蚊虫样本、鸟类样本，甚至可疑的非生物样本等，特别是可疑人群或蚊鸟等传播媒介，需要的检测方法必须适用范围广泛，而荧光（RT）-PCR方法中样本的前处理方法，操作简单，几乎可以用于所有类型的样本中这3种病原的检测。

［1］ Castle E， Nowak T， Leidner U， et al. Sequence analysis of the viral coer protein and the membrane-associated proteins V1 and NV2 of the falvivirus west Nile virus and of the genome sequence for these proteins［J］. Virology，1985， 145（2）: 227-236.

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［3］ 邓永强， 姜涛， 范宝昌， 等. 西尼罗病毒的RT-PCR监测与鉴定［J］. 微生物学免疫学进展， 2004， 32（4）: 31-35.

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［7］ 李佑民. 家畜传染病学［M］. 吉林: 中国人民解放军兽医大学出版， 1985.

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DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX REAL-TIME PCR ASSAY FOR DETECTION OF BURKHOLERIA， HEDRA VIRUS AND WEST NILE VIRUS

WANG Yan1， ZHANG Xiao-wen2， WANG Zheng2， QIU Lu1

（1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shanghai 200135， China； 2. The Food and Agricultural Products Testing Agency of Shandong Entry-Exit Inspection and Quaratine Bureau， Qingdao 266002， China； 3. Agricultural Products Safety Testing Center of Shanghai Pudong New District， Shanghai 201202， China）

A multiplex real-time PCR was developed using the primers and probes designed according to the highly conserved regions of genes of Burkholderia mallei， Hendra virus and West Nile virus reported in GenBank. The results showed that this assay was sensitive，specifi c and reproducible for detection of entry and exit equine samples.

Burkholderia mallei； West nile virus； Hendra virus； real-time PCR

S852.659.6

A

1674-6422（2016）04-0036-05

2015-12-23

上海检验检疫局科技计划项目（HK002-2015）

王艳，女，高级兽医师，主要从事动物检疫工作

王艳，E-mail：wang_yan@shciq.gov.cn