金黄色葡萄球菌疫苗候选抗原SirH和StbA及其抗血清的免疫保护作用研究

刘丽娜，钟乃凤，王 赟，周 静，张 洁

（贵州医科大学生物与工程学院，贵阳 550025）

·研究论文·

金黄色葡萄球菌疫苗候选抗原SirH和StbA及其抗血清的免疫保护作用研究

刘丽娜，钟乃凤，王 赟，周 静，张 洁

（贵州医科大学生物与工程学院，贵阳 550025）

为研究金黄色葡萄球菌疫苗候选抗原SirH和StbA及其抗血清的免疫保护作用，分别用纯化蛋白StbA、SirH以及甲醛灭活的金黄色葡萄球菌为免疫原免疫小鼠，收集抗血清，测定血清效价，然后用致死剂量的金黄色葡萄球菌攻击，评价两种抗原的免疫保护作用。分别用SirH和StbA抗血清免疫小鼠，4 h后用致死剂量的金黄色葡萄球菌攻击，评价抗血清的保护作用。结果显示，StbA和SirH抗血清效价均为1：1 638 400。金黄色葡萄球菌攻击主动免疫小鼠，SirH纯化蛋白免疫组（60%）和StbA纯化蛋白免疫组（70%）存活率均明显高于对照组（0%）（P＜0.05），金黄色葡萄球菌全菌免疫组（20%）存活率与对照组（0%）差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）。SirH纯化蛋白免疫组（60%）和StbA纯化蛋白免疫组（70%）存活率均高于金黄色葡萄球菌全菌免疫组（20%）。将抗血清免疫小鼠后，用金黄色葡萄球菌腹腔内注射攻击小鼠，免疫组小鼠16～18 h内全部死亡，而对照组小鼠在攻毒后12～14 h内全部死亡。结果表明，SirH和StbA是具有潜力的保护性抗原，但其抗血清都不具有保护作用。

金黄色葡萄球菌；疫苗抗原；抗血清；免疫保护

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），是一种重要的人兽共患病原菌，也是奶牛乳腺炎最主要的致病菌之一［1］。奶牛乳腺炎是造成奶牛养殖业主要经济损失的疾病之一，患病奶牛可出现产奶量和奶质量下降［2］。同时，携带毒素基因的金黄色葡萄球菌在适当环境温度、pH、介质下可产生毒素，影响乳产品安全，危害人体健康［3］。曾有学者开展过金黄色葡萄球菌全菌灭活苗和减毒活菌苗研究，尽管这两种疫苗能使免疫宿主的相应抗体水平显著升高，但是抗体的存在并不能起到有效的保护作用［4］，而且全菌苗抗原成份多，除保护性抗原外，还有许多不相关和有毒的成份，毒副反应较大。DNA 疫苗和亚单位疫苗联合使用可引起奶牛明显的细胞免疫反应和体液免疫反应［5］，但是导入的外源DNA 有整合到宿主基因组DNA的潜在危险［6，7］。基因工程亚单位疫苗具有组分清楚、安全性好、技术成熟、便于产业化等优点，已有较多以荚膜多糖或毒力因子作为抗原开展单组份疫苗研究的报道，但这些疫苗保护力有限［8］，而且不同金黄色葡萄球菌菌株间缺乏保守的抗原，因此，迫切需要寻找保守且保护性好的疫苗抗原。

SirH和StbA均为细胞壁锚定蛋白，位于金黄色葡萄球菌表面，被认为是有潜力的疫苗候选抗原。笔者前期在大肠杆菌中成功表达了这两个蛋白的主要抗原表位区，且纯化的重组蛋白免疫家兔能获得高效价的抗血清［9，10］。本研究开展纯化SirH和StbA的主动免疫以及其抗血清的被动免疫实验，探讨候选抗原及其抗血清的免疫保护作用，为研制具有广泛保护力的多价疫苗奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌种、动物及试剂 金黄色葡萄球菌临床分离株由贵州医科大学生物技术教研室培养和保存；SirH 和StbA重组蛋白为本实验室原核表达；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司；4周龄、9周龄雌性BALB/c小鼠，SPF级，购于山东大学实验动物中心；HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉公司。

1.2SirH和StbA重组蛋白的制备 sirH和stbA基因的克隆、表达以及表达产物的纯化参见文献［9，10］。

1.3主动免疫和细菌攻击 将4周龄小鼠分为4组，分别是PBS对照组、SirH纯化蛋白免疫组、StbA纯化蛋白免疫组和金黄色葡萄球菌全菌免疫组，每组10只。分别用纯化蛋白StbA、SirH以及甲醛灭活的金黄色葡萄球菌为免疫原，纯化蛋白按50 μg/只免疫小鼠，灭活金黄色葡萄球菌按0.5×105CFU/只免疫小鼠。首次采用免疫原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后皮下多点注射，每只100 μL。d14、21改为弗氏不完全佐剂充分乳化后以同样的剂量皮下多点免疫，对照组免疫PBS。d25断尾采血，收集抗血清。分别用纯化蛋白StbA、SirH包被96孔板，抗血清和免疫前阴性血清分别从1:400开始倍比稀释，酶标仪检测不同稀释度抗血清和阴性血清孔OD450值，以P/N＞2.1的最高血清稀释倍数作为抗血清效价。d 28用2×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌进行攻击，1 mL/只，次日起观察小鼠死亡情况，共10 d。

1.4被动免疫和细菌攻击 按1.2.2方法免疫小鼠制备StbA和SirH抗血清。被动免疫实验：将9周龄小鼠分为3组，分别是阴性血清对照组、StbA抗血清免疫组和SirH抗血清免疫组，每组10只，血清按100 μL/只免疫小鼠。4 h后，用2×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌腹腔注射小鼠，1mL/只，次日起观察小鼠死亡情况，共10 d。

1.5统计学分析 运用单侧Fisher精确检验方法分析对照组与免疫组小鼠存活率间的差异，P＜0.05为差异具备显著统计学意义。

2　结果

2.1SirH和StbA纯化重组蛋白的制备 表达的SirH 和StbA重组蛋白经GST亲和层析纯化后，用SDSPAGE电泳分析蛋白纯化情况。

2.2SirH和StbA抗血清的效价检测 间接ELISA检测抗血清效价，结果显示，SirH抗血清稀释倍数为1:3 276 800时，P/N＜2.1，故SirH抗血清效价为1:1 638 400（图1）。StbA抗血清稀释倍数为1:3 276 800时，P/N＜2.1，故StbA抗血清效价为1:1 638 400（图2）。

图1　SirH多抗血清的效价测定Fig. 1 Titer detection of mouse antibody against recombinant protein SirH

图2　StbA多抗血清的效价测定Fig. 2 Titer detection of mouse antibody against recombinant protein StbA

2.3主动免疫的保护作用 金黄色葡萄球菌攻击PBS对照组、金黄色葡萄球菌全菌免疫组、SirH纯化蛋白免疫组和StbA纯化蛋白免疫组小鼠后，观察各组小鼠的存活情况。结果显示，10只对照组小鼠，全部死于细菌攻击后24 h之内，存活率为0（0/10）；而免疫组小鼠死亡主要分布于细菌攻击后24 h内，之后小鼠死亡趋于稳定，金黄色葡萄球菌全菌免疫组存活率为20%（2/10），SirH纯化蛋白免疫组存活率为60%（6/10），StbA纯化蛋白免疫组存活率为70%（7/10）（图3）。SirH纯化蛋白免疫组和StbA纯化蛋白免疫组存活率均明显高于对照组（P＜0.05），金黄色葡萄球菌全菌免疫组存活率与对照组差异不具备显著统计学意义（P＞0.05），SirH纯化蛋白免疫组存活率（60%）和StbA纯化蛋白免疫组存活率（70%）均高于金黄色葡萄球菌全菌免疫组（20%）。

图3　主动免疫保护试验中小鼠的存活情况Fig. 3 Survival time of actively immunized mice after lethal challenge with S.aureus

2.4SirH和StbA抗血清的免疫保护作用 抗血清免疫后4 h，用2×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌腹腔内注射攻击小鼠，1 mL/只。攻毒后24 h内，免疫组和对照组小鼠全部死亡，其中免疫组小鼠16～18 h内全部死亡，对照组小鼠攻毒后12～14 h内全部死亡。

3　讨论

奶牛乳腺炎不仅对奶牛乳腺组织造成损伤，严重影响奶牛的使用年限，而且还使奶产量降低，影响牛奶的品质和营养价值。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原，不仅给乳品工业带来巨大损失，而且还危害到公共卫生和人类健康，疫苗防治是控制该病的首选。

SirH和StbA都是金黄色葡萄球菌的细胞壁锚定蛋白，位于细菌表面，容易接触宿主的免疫系统，被免疫活性细胞识别，从而刺激免疫应答的产生。SirH蛋白N端存在信号肽序列，C端含有细胞壁锚定基序LPQTG；StbA蛋白N端存在信号肽序列，C端含有细胞壁锚定基序LPKTG。通常含有细胞壁锚定基序如LPXTG、LPQTG、LPKTG等的细胞壁锚定蛋白都是有潜力的疫苗靶标［11-13］。主动免疫保护试验证实免疫SirH或StbA诱导的免疫应答能保护小鼠免受致死剂量的金黄色葡萄球菌攻击，重组蛋白免疫组小鼠存活率均高于金黄色葡萄球菌全菌免疫组，表明SirH和StbA是有潜力的保护性抗原。

SirH和StbA都能诱导小鼠机体产生高效价的抗血清，但抗血清不具有保护作用，由此推测SirH 和StbA诱导的保护性免疫应答可能是由细胞免疫介导。对金黄色葡萄球菌感染的免疫保护机制研究表明，机体的CD4+T细胞和CD8+T细胞反应对金黄色葡萄球菌感染的免疫保护是必需的［14］。另有研究报道，金黄色葡萄球菌乳腺炎的疫苗需要能够有效诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞的免疫反应［8］。因此，保护性疫苗的研究方向是研制能有效刺激细胞免疫应答的疫苗。

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PROTECTION AGAINST LETHAL CHALLENGE WITH STAPHYLOCOCCUS AUREUS BY INJECTION OF RECOMBINANT SIRH， STBA OR THEIR SPECIFIC ANTISERA

LIU Li-na， ZHONG Nai-feng， WANG Yun， ZHOU Jing， ZHANG Jie
（School of Biology & Engineering， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China）

In order to investigate immunoprotection of vaccine antigen candidates SirH and StbA and their specifi c antisera against Staphylococcus aureus infection， mice were respectively immunized with the purifi ed recombinant proteins and antisera of candidate antigens， and then the immunized mice were challenged with the lethal dose of Staphylococcus aureus. The result showed that antibody titers of mouse sera immunized with the recombinant SirH or StbA were both 1：1 638 400. All actively immunized mice were injected with a lethal dose of Staphylococcus aureus. The survival rates in the SirH-immunized group （60%） and the StbA-immunized group （70%）were both signifi cantly higher than that in the control group （0%） （P＜0.05）. The survival rates between the whole-cell bacterial vaccine group （20%） and the control group （0%） have no signifi cant difference （P＞0.05）. The survival rates in the SirH-immunized group （60%）and the StbA-immunized group （70%） were both higher than in the whole-cell bacterial vaccine group （20%）. Mice in the antiserumimmunized group and control groups were challenged with a lethal dose of Staphylococcus aureus. The antiserum-immunized mice were all dead within 16 to 18 hours， whereas mice in control group were dead within 12 to 14 hours after challenge. In conclusion， SirH and StbA are both potential protective antigens， but the SirH- or StbA-specifi c antiserum could not protect mice from lethal challenge with Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus； vaccine antigens； antisera； immunoprotection

S852.611

A

1674-6422（2016）04-0048-04

2016-04-26

国家自然科学基金项目（31360084）；贵州省科技合作计划（黔科合LH字［2015］7318）

刘丽娜，女，博士，主要从事微生物学方面研究

刘丽娜，E-mail：strawberry2@126.com