一种共表达不同亚型禽流感病毒基因且形成病毒样颗粒的真核表达载体的构建与鉴定

于周璐，滕巧泱，崔宏锐，荣广玉，李雪松，杨健美，陈鸿军，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

·研究论文·

一种共表达不同亚型禽流感病毒基因且形成病毒样颗粒的真核表达载体的构建与鉴定

于周璐，滕巧泱，崔宏锐，荣广玉，李雪松，杨健美，陈鸿军，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

动物流感DNA疫苗是非常有应用前景的新型疫苗之一，本研究构建了能同时表达禽流感病毒2种血凝素H5HA和H9HA以及1种神经氨酸酶N1NA的真核表达质粒。间接免疫荧光结果表明，构建的真核表达质粒转染MDCK细胞后，同时表达出H5HA、H9HA和N1NA蛋白；转染293T细胞上清通过血凝试验可检测到24血凝价；通过透射电镜观察到了病毒样颗粒。本研究用一种质粒同时表达不同亚型流感病毒蛋白并且形成了病毒样颗粒，为流感病毒多价DNA疫苗研究提供了坚实基础。

禽流感；病毒样颗粒；H5HA；H9HA；N1NA

禽流感（avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的呼吸道系统和全身性疾病为临床特征的禽类烈性传染病的总称。禽流感病毒属于正粘病毒科、流感病毒属，为多形态、有囊膜、单股负链、分节段的RNA病毒。其中血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）是禽流感病毒粒子的主要表面抗原，在禽流感病毒样颗粒的包装及释放过程中起主要作用，并且能够诱导免疫保护的作用。

2016年H5、H9亚型禽流感在世界范围的蔓延爆发，给当地家禽养殖业带来了巨大的经济损失，这使得对于H5、H9亚型禽流感疫苗的研制迫在眉睫。流感病毒样颗粒是研究病毒包装及出芽等生物学机制的手段，也是流感病毒新型疫苗开发的突破口［1-7］。研究人员主要采用重组杆状病毒系统［8-10］，建立稳定表达的细胞系［11］以及共转染表达［12，13］的方法对流感病毒样颗粒进行研究。有研究表明HA和NA对于形成并释放病毒样颗粒具有重要作用［14-18］，但是也有报道显示HA和NA在病毒的包装释放中不起作用［19-21］。为了验证插入同一表达载体的不同亚型的HA和NA基因是否能表达出相对应的流感病毒蛋白以及是否参与流感病毒样颗粒的形成，本研究构建了同时能表达H5HA、H9HA和N1NA蛋白的真核表达质粒。构建的真核表达质粒转染MDCK细胞后，同时表达出H5HA、H9HA和N1NA蛋白，证明了该真核表达系统功能的完整性。转染293T细胞上清通过血凝试验可以初步判断是否有病毒样颗粒的包装与释放。将转染后的293T细胞上清经高离、超离等纯化步骤收集病毒颗粒，通过透射电镜观察到了病毒样颗粒，证实了包装系统的可行性。本研究用一种质粒同时表达不同亚型流感病毒蛋白并且形成了病毒样颗粒，为流感病毒多价DNA疫苗研究提供了坚实基础。

1　材料与方法

1.1质粒 含有密码子优化的N1NA、H5HA和H9HA基因的质粒，由北京英茂盛业生物科技有限公司提供；真核表达载体pCAGGS-IRES载体由上海兽医研究所动物流感病毒病原生态学创新团队保存（图1）；DH5α宿主菌购买于北京全式金生物技术有限公司。

图1　pCAGGs-IRES简明载体图Fig. 1 The simple vector map of pCAGGs-IRES

1.2引物的设计合成 用软件Primer Primier 5.0设计所有引物，由上海美吉生物医药科技有限公司合成，基因扩增引物序列见表1。

表1　基因扩增引物Table 1 The premiers for amplifi cation

1.3一抗和二抗 H5HA与H9HA一抗由上海兽医研究所动物流感病毒病原生态学创新团队保存；N1NA一抗购自GeneTex公司；辣根标记的二抗兔抗鸡IgG、羊抗鼠IgG购自Sigma公司。

1.4表达质粒pCAGGS-H5HANA-H9HA的构建

1.4.1质粒pCAGGS-N1NA的构建 首先对扩增引物GD-NA-1424-F进行磷酸化，然后以密码子优化的基因N1NA质粒为模板进行PCR扩增NA基因，PCR扩增产物用Bgl II酶进行酶切处理，同时pCAGGSIRES载体用Bgl II酶和Msc I酶进行酶切后与处理好的NA片段进行连接，使NA基因置于β-acting启动子之下，将构建好的载体命名为pCAGGS-N1NA。

1.4.2质粒pCAGGS-H5HANA的构建 以密码子优化的H5HA质粒为模板进行PCR扩增HA基因，PCR扩增产物用EcoR I酶和Xho I酶进行双酶切处理。pCAGGS-N1NA载体用EcoR I酶和Xho I酶进行双酶切后，与处理好的HA片段进行连接，使HA基因置于β-acting启动子之下，将构建好的载体命名为pCAGGS-H5HANA。

1.4.3表达HA、NA蛋白质粒pCAGGS-H5HANAH9HA的构建 以密码子优化H9HA质粒为模板，PCR扩增HA基因，扩增产物用Nhe I酶进行酶切处理。pCAGGS-H5HANA载体用Nhe I酶进行酶切后与相同酶处理的HA片段进行连接，使HA基因置于SV40启动子之下，并将构建好的表达质粒命名为pCAGGS-H5HANA-H9HA。

1.5间接免疫荧光检测（indirect immunofl urescence analysis，IFA）HA、NA基因的表达 将MDCK传于6孔板中，密度达到70%左右时，按照脂质体Mirus说明，以2 μg的pCAGGS-H5HANA-H9HA质粒量进行转染。转染48 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次；用0.5%Triton浸透5 min，PBS漂洗3次；加1%BSA 37℃封闭1 h，PBS漂洗3次；然后在相应的孔中分别加入稀释200倍的H5的HA一抗、H9的HA一抗、H5N1的NA一抗，37℃孵育1 h，PBS漂洗3次；分别对应加入1:1000稀释的辣根标记羊抗鼠IgG二抗、辣根标记兔抗鸡二抗，37℃孵育1 h，PBS漂洗3遍，在荧光显微镜下观察结果。

1.6血凝实验检测病毒样颗粒包装 转染前24 h将293T细胞传于 6 孔板，待其密度达到约 80%以上，将构建好的质粒pCAGGS-H5HANA-H9HA以 2 μg/孔，按常规方法转染于 293T 细胞。转染 48 h 后，取 50 μL 转染的细胞上清，在血凝板上用PBS 进行2 倍倍比稀释，然后加入等体积的 0.5% 鸡红细胞，室温静置 20～30 min，观察血凝结果。

1.7透射电子显微镜观察病毒样颗粒形 转染前 24 h 将 293T 细胞传代于2个100 mm×20 mm的大培养皿中，待细胞密度达到 70%，按脂质体Mirus说明书操作，将质粒GD-HA-GD-NA-441-HAPCAGGS-H5HANA-H9HA转染至293T细胞，转染量为 10 μg/皿，转染后 6 h 换正常培养基，每个培养皿补充约 20 mL 培养基。培养48 h 后收集细胞上清，4℃、3000×g（水平转子）离心30 min，收集上清，然后将上清于4℃、10 000×g 离心1 h，以上两步操作能去除细胞脆片及杂质。将收集到的细胞上清置于超速离心机，4℃、60 000×g 离心4 h。离心后轻轻弃去上清，用 1 mL STE溶液重悬沉淀物并混匀。将得到的沉淀物悬浊液进行蔗糖梯度离心，在离心管中由下至上依次加入60%、30%和15%的蔗糖溶液，最上方加入沉淀物悬浊液，4℃、60 000×g离心4 h。吸取纯化后的病毒层用STE缓冲液稀释，3000×g超速离心后用1 mL PBS溶解，得到最终的病毒纯化液。取50 μL进行血凝效价的测定，剩余的样品稀释固定于铜网上，用磷钨酸复染，通过透射电子显微镜（日本 GEM2100）观察。

2　结果

2.1表达质粒pCAGGS-H5HANA-H9HA的构建 凝胶电泳结果显示有3条大小不同的特异性片段，大小分别为1.4、1.7、1.7 kb。经测序鉴定序列正确，表明N1NA、H5HA和H9HA片段已经成功插入到pCAGGS质粒载体相对应的位点，即pCAGGSH5HANA-H9HA构建成功。

2.2IFA HA与NA的表达 将表达质粒pCAGGSH5HANA-H9HA转染至MDCK细胞，可观察到N1NA、H5HA和H9HA蛋白的表达（图2）。

2.3血凝试验初步鉴定病毒样颗粒的包装 以 2 μg/孔的质粒浓度转染 293T 细胞，48 h之后检测血凝效价，结果表明转染后表达质粒pCAGGS-H5HANAH9HA出现血凝效价，效价最高可以达到 24。

2.4透射电子显微镜观察病毒样颗粒 经蔗糖纯化超速离心后，进行血凝效价的测定，同时表达N1NA、H5HA和H9HA蛋白的血凝效价达到28。将样品处理后置于透射电子显微镜下观察，可观察到病毒样颗粒的形态（图3）。病毒样颗粒呈圆形、椭圆形等不规则形态，中心空洞但边缘致密呈空壳状。

图2　PCAGGS-H5HANA-H9HA重组质粒表达产物的间接免疫荧光检测Fig. 2 Detection of N1NA， H5HA， H9HA expression in MDCK cells transfected with pCAGGS-H5HANA-H9HA plasmid by IFA

图3　病毒样颗粒形态Fig. 3 Morphology of virus like particle（VLP）

3　讨论

真核表达质粒pCAGGS-IRES载体上有SV40启动子、鸡的β-actin启动子和CMV增强子，将密码子优化的基因H5HAH5NAH9HA片段克隆到质粒载体pCAGGS-IRES上的对应位置。通过IFA显示插入到真核表达载体上的3个基因片段分别表达相对应的蛋白。将表达质粒pCAGGS-H5HANA-H9HA瞬时转染293T细胞，通过血凝实验证明存在血凝效价，并且在48 h后达到最高值24，说明转染后存在血凝活性。将收集到的293T细胞上清进行高离、超离以及蔗糖梯度离心纯化后，在透射电子显微镜下观察发现有明显的病毒样颗粒，这也验证了插入HA和NA基因的真核表达质粒能有效的表达病毒样颗粒，表明HA和NA结构蛋白在病毒样颗粒的包装与释放中起着重要的作用，很多文献报道也证实了这一结论［1，22-25］。之前研究对于病毒样颗粒包装与释放的主要结构蛋白结论不一，主要是由于包装系统不同或者是不同亚型的病毒结构蛋白存在差异，这需要进一步的探索和研究。

本研究采用的真核表达系统包装病毒样颗粒的方法简单易于操作，同时存在多个克隆位点，为流感病毒的生物学特性研究提供了有力的工具。同时，由于病毒样颗粒具有很强的免疫原性和生物活性，并且不具有感染性，采用真核表达系统包装病毒样颗粒在流感病毒疫苗的研究方面具有很好的应用前景。

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CONSTRUCTION OF THE PLASMID EXPRESSING H5/H9 HEMAGGLUTININ SUBTYPES OF AND N1 NEURAMINIDASE OF AVIAN INFLUENZA VIRUS

YU Zhou-lu， TENG Qiao-yang， CUI Hong-rui， RONG Guang-yu， LI Xue-song， YANG Jian-mei，CHEN Hong-jun， LI Ze-jun

（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China）

The DNA vaccine is one of the most promising novel vaccines against animal infl uenza. In the present study， the eukaryotic expressing plasmid that co-expressed H5HA， H9HA and N1NA was constructed. All proteins of H5HA， H9HA and N1NA were detected in indirect immunofl uorescence analysis （IFA） on the transfected MDCK cells. In the supernatants of the transfected 293T cells， HA titer were 24and the virus like particles （VLPs） were detected under electron microscope. The proteins from different subtypes of infl uenza were co-expressed by one plasmid and formed VLPs， which provided sold fourdation for development of the polyvalent DNA vaccines against infl uenza.

Avian infl uenza； virus like particles； H5HA； H9HA； N1NA

S852.659.5

A

1674-6422（2016）04-0013-06

2016-12-22

自然科学基金（面上）项目（31472206）

于周璐，男，硕士研究生，预防兽医学专业

李泽君，E-mail：lizejun@shvri.ac.cn