RP-HPLC测定八珍益母汤剂两种煎药方法芍药苷和阿魏酸的含量△

冯成，王硕仁，张鹏，曹俊岭，吴爱明，娄利霞，闫彦芳，聂波*

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2.北京中医药大学东直门医院 中医内科学教育部和北京重点实验室，北京 100700；3.北京中医药大学东直门医院 骨科，北京 100700；4.北京中医药大学东直门医院 药学部，北京 100700)

RP-HPLC测定八珍益母汤剂两种煎药方法芍药苷和阿魏酸的含量△

冯成1，王硕仁2，张鹏3，曹俊岭4，吴爱明2，娄利霞2，闫彦芳2，聂波2*

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2.北京中医药大学东直门医院 中医内科学教育部和北京重点实验室，北京 100700；3.北京中医药大学东直门医院 骨科，北京 100700；4.北京中医药大学东直门医院 药学部，北京 100700)

目的：比较传统砂锅和煎药机煎煮八珍益母汤对芍药苷和阿魏酸含量的影响。方法：采用传统砂锅和煎药机煎煮制备八珍益母汤，反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定煎液中芍药苷和阿魏酸的含量。色谱条件：ImtaktC18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸(14∶86，ν/ν)溶液；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为芍药苷230 nm，阿魏酸322 nm；柱温为25 ℃。结果：芍药苷在传统砂锅煎液中含量略高于煎药机煎液；阿魏酸在两种煎液中含量相近。结论：传统砂锅煎煮与煎药机煎煮八珍益母汤剂中主要有效成分含量差异不明显。

传统砂锅煎煮；煎药机煎煮；八珍益母汤剂；芍药苷；阿魏酸；含量测定

八珍益母方由益母草、党参、炒白术、茯苓、甘草、当归、川芎、酒白芍、熟地黄9味中药组成，具有益气养血、活血调经的功能，临床广泛用于治疗气血两虚兼血瘀之月经不调及多种内科疾病，疗效显著[1]。中药汤剂是中医临床应用最早、最广泛、药效最可靠的剂型，其煎煮质量直接影响临床疗效。中药煎药机代替传统砂锅煎药已被广泛应用。但两种煎药方法对汤剂中有效成分的影响一直是人们普遍关注问题，煎煮条件对汤剂化学成分及其药效的影响值得深入系统地研究。因此，本文选择临床常用的补益方剂——八珍益母汤剂为研究对象，采用HPLC法对煎药机与传统砂锅煎煮制备的两种八珍益母汤剂中的芍药苷和阿魏酸含量进行检测，以比较两种煎药方法对八珍益母方有效成分煎出的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器

东华YFY-20煎药机(北京东华原医疗设备有限责任公司)；普通砂锅；岛津LC-10Avp高效液相色谱仪(由2个LC-10ATvp输送泵、CTO-ASvp柱温箱、Rheodyne 7725i手动进样阀、SPD-M10Avp紫外-可见二极管阵列检测器、CLASS-VP色谱工作站和电脑组成)；岛津AEG-45SM十万分之一分析天平；GILSON x57356A移液管；TP 300超声波清洗机；SIGMA 3K15台式低温高速冷冻离心机(西安特普讯仪器设备有限公司)；Mill-Q A10+纯水机；RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；狮鼎5HB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；康乐DZF-1型真空干燥箱(上海医用恒温设备厂)。

1.2 材料

芍药苷对照品、阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为10736-200631，110773-200611)；处方药材均购自北京白塔寺药店，经北京中医药大学中药学院闫永红教授鉴定为合格品；煎药机煎液由中国中医科学院广安门医院煎药室制备；砂锅煎液为北京中医药大学东直门医院重点实验室自制；85%磷酸(Fluka，HPLC级)；甲醇(MERCK，HPLC级)；乙腈(J.T.Baker，HPLC级)；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 砂锅煎液制备

将八珍益母汤剂1剂置砂锅内，加10倍量水，浸泡30 min，武火加热至沸，改为文火煎煮40 min，倒出煎液；药渣加水8倍量水，武火加热至沸，改文火煎煮25 min，合并2次煎液，过滤后，分装，4 ℃冰箱保存备用。重复以上操作3批次，平均一剂煎液体积为650 mL。同法分别制备缺酒白芍、缺川芎和当归的两种阴性煎液。

2.2 煎药机煎液制备

将八珍益母汤剂6剂混合均匀后装入无纺布袋内，置煎药机内，加水4200 mL，浸泡30 min后，再加3900 mL水，开始加热。温度升到120 ℃，压力增至0.12 kPa停止加热。出液包装，弃去前2袋，按出袋顺序依次编号，每袋200 mL。重复上述操作3批次。同法分别制备缺酒炒白芍、缺川芎和当归的两种阴性对照煎液。

2.3 对照品溶液的制备

精密量取经105 ℃五氧化二磷减压干燥36 h的芍药苷对照品4.94 mg，置5 mL棕色量瓶内，用HPLC级甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得芍药苷对照品储备液，质量浓度为0.988 mg·mL-1；精密量取经105 ℃五氧化二磷减压干燥36 h的阿魏酸对照品10.19 mg，置10 mL棕色量瓶内，用HPLC级甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得阿魏酸对照品储备液，质量浓度为1.019 mg·mL-1；分别精密量取400 μL芍药苷和阿魏酸对照品储备液，置同-5 mL棕色量瓶内，用HPLC级甲醇定容至刻度，摇匀，即得含芍药苷和阿魏酸混合对照品溶液，质量浓度分别为0.070 94、0.081 52 mg·mL-1。

2.4 供试品溶液的制备

精密量取相当于原生药2.6 g的八珍益母汤于鸡心瓶内，置旋转蒸发仪水浴50 ℃浓缩至约5 mL，转移至10 mL量瓶内，逐滴加入甲醇至刻度(边加边振摇)，超声25 min，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，离心(13 000 r·min-1，10 ℃，10 min)，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5 色谱条件

色谱柱：lmtakt C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水(14∶86，v/v)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：芍药苷为230 nm，阿魏酸为322 nm；柱温：25 ℃。

2.6 系统适应性及专属性试验

分别精密量取芍药苷对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液、缺芍药阴性供试品溶液和缺川芎、当归阴性供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，结果见图1(因两种煎液色谱图近似，仅列煎药机煎液样品色谱图)。

注：A.对照品；B、C.煎药机煎液供试品(不同波长下)；D.缺芍药阴性供试品；E、F.缺川芎、当归阴性供试品(不同波长下)；1.芍药苷；2.阿魏酸。图1 八珍益母汤剂HPLC图

如图1可知，芍药苷保留时间为19.86 min，阿魏酸保留时间为34.21 min，供试品色谱图在对照品对应位置出现相应色谱峰，且芍药苷、阿魏酸色谱峰分别与前后色谱峰分离良好。缺芍药阴性供试品溶液和缺川芎、当归阴性供试品溶液在相应位置不出现色谱峰。结果表明，系统适应性良好，其他成分对芍药苷、阿魏酸的测定无干扰。

2.7 标准曲线的绘制

取2.3项下芍药苷和阿魏酸对照品储备液各10、40、100、200、600、1000 μL，置同一5 mL棕色量瓶内，加入HPLC级甲醇定容至刻度，摇匀，即得一系列含芍药苷和阿魏酸的混合对照品溶液。分别取混合对照品溶液各10 uL，进样测定。以对照品芍药苷、阿魏酸含量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算回归方程，芍药苷、阿魏酸分别在0.079 04～1.976 00 μg、0.020 38～2.038 00 μg呈良好的线性关系。回归方程分别为Y1=1 614 355X1-41 391.2，r=0.999 8(n=6)；Y2=6 196 894X2-57 151.2，r=0.999 9(n=6)。

2.8 精密度试验

精密量取同一混合对照品溶液10 μL，重复进样测定6次，结果峰面积RSD分别为芍药苷1.59%，阿魏酸0.61%，表明仪器精密度良好。

2.9 稳定性试验

精密量取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、16 h注入液相色谱仪测定，峰面积RSD分别为芍药苷1.05%，阿魏酸0.22%，表明芍药苷和阿魏酸在16 h内稳定性良好。

2.10 重复性试验

精密量取同一批砂锅煎液5份，按供试品溶液制备方法平行制备5份，进样测定。结果芍药苷平均质量浓度为0.086 01 mg·mL-1，RSD为1.63%；阿魏酸平均质量浓度为0.017 29 mg·mL-1，RSD为1.94%，说明该样品处理方法重复性良好。

2.11 加样回收率试验

精密量取已知含量的砂锅煎液6份，分为2组，按比例精密加入一定量的对照品，按照供试品溶液制备方法处理，依法测定芍药苷和阿魏酸的含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

注：回收率=(测得量-样品中量)/加入量×100%。

2.12 样品测定结果

分别取砂锅煎液和煎药机煎液，按供试品制备方法处理，并按照所建立的色谱条件进样测定，计算煎液中芍药苷、阿魏酸含量。同时按《中华人民共和国药典》2015版规定方法分别测定生药白芍中芍药苷含量和生药当归、川芎中阿魏酸含量。根据以上数据，计算芍药苷和阿魏酸的提取率，同时使用SPSS16.0统计软件，采用独立T检验，分析两组间芍药苷和阿魏酸含量的差异，p>0.05，两种煎煮方法获得的芍药苷和阿魏酸含量差异不具有统计学意义，见表2。

表2 八珍益母方煎液中芍药苷和阿魏酸的提取率

注：提取率=煎液中指标成分含量(mg)/对应生药中该成分含量(mg)×100% 。

3 讨论

3.1 色谱条件的确定

[2-5]所采用的色谱方法，本研究尝试乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸等多种流动相，结果乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸溶剂系统下芍药苷和阿魏酸有不同程度的拖尾，而在乙腈-0.1%磷酸(14∶86，v/v)系统下分析时，芍药苷、阿魏酸与前后色谱峰分离良好，故采用该溶剂系统为分析用流动相。尝试采用梯度洗脱程序(0 min，乙腈-0.1%磷酸(14∶86)；30 min，乙腈-0.1%磷酸(15∶85)，虽能一定程度上缩短分析时间，但系统保留时间不够稳定，阿魏酸的分离度过小。

3.2 供试品处理方法

尝试将煎液直接经0.22 μm微孔滤膜滤过，进样分析，发现色谱图上杂质峰较多，芍药苷和阿魏酸不能很好分离，且不利于色谱仪的维护。改用取煎煮液浓缩后加甲醇超声的方法，能有效去除杂质峰，显著改善分离效果，且有利于色谱仪的维护，加样回收率试验符合要求，故选用此法处理供试品。

3.3 不同煎药方法对汤剂有效成分含量影响的比较

比较八珍益母汤两种煎液中芍药苷、阿魏酸的煎出率可知，芍药苷在传统砂锅煎液中含量略高于煎药机煎液，分析其原因：芍药苷易溶于水，且结构稳定，故在两种煎药方法下，均得到很好的煎出;而传统砂锅煎煮条件下，煎煮时间较长，故芍药苷的煎出率略高于煎药机煎煮，但差异不具有统计学意义(p>0.05)。阿魏酸易溶于水，但结构不够稳定，故煎煮时间长会导致其降解，而含量下降，因此，传统砂锅煎煮的含量略低于煎药机煎煮。但差异不具有统计意义。在一定程度上说明，传统砂锅煎药方法与机器煎药方法对于某些水溶性且结构稳定的化学成分的煎出影响不大。

课题组曾以清热解表代表方感冒清热汤剂为研究对象，比较传统煎药和煎药机煎药对汤剂中有效成分含量的影响，结果显示，在机煎液中葛根素的煎出率较高，而砂锅液中升麻苷的煎出率较高，两者中5-O-甲基维斯阿米醇苷的煎出率相近[6]。本试验以补益药代表方八珍益母汤为研究对象，比较两种煎药方法对芍药苷含量的影响，结果显示，传统砂锅煎液芍药苷含量略高于煎药机煎液，阿魏酸则略低于煎药机煎液，但差异不明显。分析原因，两种煎药方法在加热温度、时间、压力等方面存在差异，产生上述不同结果涉及到中药所含有的化学成分的溶解性、稳定性、pH值、共存的化学成分等多种复杂因素，具体选择哪种煎药方式、对有效成分的影响如何、是否影响临床疗效等，有待于进一步深入研究。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 李顺意，蔡敏，韩凤梅，等.高效液相色谱法测定八珍益母颗粒中芍药苷和阿魏酸的含量[J].中国中药杂志，2001，26(9)：631-632.

[3] 马向东.HPLC法测定八珍益母丸中芍药苷和阿魏酸的含量[J].中国药物评价，2014，31(4)：193-195.

[4] 葛尔宁.RP-HPLC法测定不同煎煮方法下当归芍药汤中阿魏酸和芍药苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2005，11(6)：16-17.

[5] 王文渊，龙红萍，卜生高.HPLC同时测定六味补血颗粒中芍药苷和阿魏酸的含量[J].湖南师范大学学报(医学版)，2008，5(1)：58-60.

[6] 龚慕辛，薛然，聂波，等.不同煎药方法对感冒清热汤剂质量的影响[J].中药新药与临床药理，2009，20(1)：44-46.

ContentDeterminationofPaeoniflorinandFerulicAcidinBazhenYimuDecoctionPreparedwithTwoDecoctingMethodsbyRP-HPLC

FENG Cheng1，WANGShuoren2，ZHANGPeng3，CAOJunling3，WUAiming2，LOULixia2，YANYanfang2，NIEBo2*

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2.KeyLaboratoryofChineseInternalMedicineofMinistryofEducationandBeijing,DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China;3.DepartmentofOrthopaedicsDongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China; 4.DepartmentofPharmacy,DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective：To compare effects on the contents of paeoniflorin and ferulic acid in Bazhen Yimu Decoction (BYD) prepared by machine-boiling method and marmite-boiling method.Method：BYD was decocted by traditional marmite and decocting machine respectively.Then the content of paeoniflorin and ferulic acid in the decoction were determinedby RP-HPLC.Imtakt C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) was used with acetonitrile:0.3% phosphoric acid (14∶86) as the mobile phase, the flow rate was 1.0 mL/min, and the detection wavelengths of paeoniflorin and ferulic Acid were set at 230 nm and 322 nm with temperature at 25 ℃.Results:The content of paeoniflorin was slightly higher, and that of ferulic acid was similar in the marmite-boiling-decoction than those in the machine-boiling-decoction.Conclusion:The differences was not obvious from the contents of main effective components in the decoctions of BYD prepared by between machine-boiling method and marmite-boiling method.

Marmite-boiling；machine-boiling；Bazhen Yimu Decoction；paeoniflorin；ferulic acid; content determination

2016-04-07)

北京市教育委员会共建项目

*

聂波，博士，副研究员，研究方向：中药药理与中药体内代谢了；E-mail：nieboww_1977@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.023