化州柚入药部位的探讨

张秋玲，伍柏坚，黄晓丹，陈康，林励*

(1.广州市中医医院，广东 广州 510130；2.广州王老吉药业股份有限公司，广东 广州 510450；3.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

化州柚入药部位的探讨

张秋玲1，伍柏坚2，黄晓丹2，陈康3，林励3*

(1.广州市中医医院，广东 广州 510130；2.广州王老吉药业股份有限公司，广东 广州 510450；3.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

目的：对化州柚外果皮、中果皮、果瓤进行研究，探讨其入药部位，为化州柚资源充分利用奠定基础。方法：采用紫外分光光度法测定化州柚外果皮、中果皮、果瓤的总黄酮含量，采用HPLC测定柚皮苷含量和色谱指纹图谱相似度，结合药效学研究，探讨化州柚的入药部位。结果：化州柚果实各部位总黄酮、柚皮苷含量大致相仿，色谱指纹图谱相似度较高；外果皮、中果皮、果瓤与全果均能延长小鼠咳嗽潜伏期和减少小鼠的咳嗽次数，组间比较无统计学差异。结论：化州柚以全果入药存在一定科学性与合理性。

化州柚；入药部位；总黄酮；柚皮苷；指纹图谱；镇咳；小鼠

《中华人民共和国药典》(《中国药典》)2010版中规定化橘红为芸香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，具有理气宽中、燥湿化痰的功效[1]。这两种植物基原中，前者化州柚习称为“毛橘红”，是特产于广东省化州市的道地药材，其质量明显优于后者，明清两代曾列为皇室贡品，被公认为理气化痰的首选药材。化州柚主要有效成分是柚皮苷等黄酮类化合物，其中柚皮苷是《中国药典》2010版规定的含量测定指标成分，具有显著的消炎作用[2]。收载化州柚的入药部位被《中国药典》2010版定为干燥外层果皮，但自古以来道地产区化州市就将化州柚未成熟干燥全果入药，习称为橘红珠[3]。为探讨充分利用化州柚资源的可行性，缓解道地药材紧缺的局面，作者进行了本项研究。

1 仪器、试药与材料

1.1仪器

1200系列高效液相色谱仪，G1322A在线真空脱气机，G1311A四元梯度泵，G1329A自动进样器，G1316A 柱温箱，G1315B DAD紫外检测器(美国 Agilent)；Precisa XS225A型电子分析天平(瑞士，0.1 mg)；鱼跃牌YUYUE402A超声雾化器(上海鱼跃医疗设备有限公司)。

1.2 材料

柚皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110722-200610)；野漆树苷对照品(自制，纯度：98.57%)HPLC用甲醇为色谱纯，水为超纯水；其他所用试剂均为分析纯；可立停(磷酸苯丙哌啉口服溶液，北京九龙制药有限公司，批号：120803)。

化州柚鲜果[直径(6.8±0.2) cm，(110±10) g，化州绿色生命有限公司化州柚GAP基地]，2012年4月采收，经广东省中药研究所蔡岳文主任中药师鉴定其基原为化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’。置沸水中烫2 min，取烫制后部分果实分割成外果皮、中果皮、果瓤，上述不同部位及全果于60 ℃烘干，打成粗粉备用。

1.3 动物

SPF级NIH小鼠，雌雄各半，体重18～22 g(广州中医药大学实验动物中心)，合格证号：粤监证字2012A005。

2 方法

2.1 紫外分光光度法测定总黄酮含量

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷对照品0.010 10 g，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 样品溶液的制备 取化州柚全果及不同部位的粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，水浴加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得样品溶液A；再精密量取续滤液5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[4]。

2.1.3 标准曲线制备 分别精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置25 mL量瓶中，然后分别加入100 g·L-1硝酸铝溶液1 mL，加甲醇至刻度，摇匀，放置15 min；另取100 g·L-1硝酸铝溶液 1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照溶液。分别于306 nm处测定吸光度，得线性回归方程为Y= 37.331X-0.002(r=0.999 8)，线性范围为0.004 28～0.042 8 mg·mL-1。

2.1.4 样品总黄酮含量测定 将各样品分别按上述方法制备样品溶液，精密量取样品溶液1.0 mL置25 mL量瓶中，加入100 g·L-1硝酸铝溶液1 mL，加甲醇至刻度，摇匀，放置15 min，于306 nm处测定吸光度。代入回归方程，计算各样品总黄酮含量。

2.1.5 方法学考察 精密度试验的RSD=0.56%；稳定性试验90 min内RSD=1.01%；重现性试验的RSD=1.12%；加样回收率试验平均回收率为98.85%，RSD=1.82%。

2.2 HPLC法测定化州柚柚皮苷含量

2.2.1 色谱条件 流动相：A(甲醇)-B[水-乙酸(61∶4)](40∶60)，流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；色谱柱：Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：283 nm[2-4]。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密量取总黄酮测定项下的柚皮苷对照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，质量浓度为0.101 0 mg·mL-1。

2.2.3 样品溶液的制备 取总黄酮测定项下制备的样品溶液。

2.2.4 标准曲线制备 取上述对照品溶液，分别进样2、4、8、10、15、20 μL，按上述色谱条件进行测定，得回归方程为Y= 28.98X-2.409 7(r=0.999 8)，线性范围为0.202～2.020 μg。

2.2.5 样品柚皮苷含量测定 取各样品溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，进样10 μL，依法测定，外标峰面积法计算柚皮苷含量。

2.2.6 方法学考察 柚皮苷含量测定的精密度试验的RSD=0.62%；稳定性试验8 h内RSD=0.92%；重现性试验的RSD=1.43%；加样回收率试验的平均回收率为98.74%，RSD=1.62%。

2.3 HPLC色谱指纹图谱分析

2.3.1 色谱条件 流动相：A(甲醇)-B[水-乙酸(61∶4)]，二元梯度洗脱(0～10 min，0%～10% A；10～15 min，10%～13% A；15～20 min，13%～25% A；20～50 min，25%～55% A；50～55 min，55%～62% A；55～60 min，62%～70% A；60～70 min，70%～100% A；70～75 min，100% A)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：283 nm；柱温：25 ℃；色谱柱：Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)[4-5]。

2.3.2 样品溶液的制备 取总黄酮测定的样品溶液制备项下样品溶液A，精密量取50 mL，水浴上蒸干，加适量甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 样品指纹图谱测定 取各样品溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，进样10 μL，测定并记录色谱图。

2.3.4 方法学考察 取外果皮供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h进行测定，柚皮苷保留时间的RSD和峰面积的RSD分别为0.46%和0.94%；取外果皮供试品溶液，连续进样5次，柚皮苷保留时间的RSD和峰面积的RSD分别为0.86%和0.94%；取外果皮供试品溶液5份，峰面积比例大于1%的5个主要色谱峰保留时间RSD均低于1.0%，保留时间RSD均低于1.81%。

3 药效学研究

3.1 受试药的制备

称取化州柚外果皮、中果皮、果瓤、全果粗粉各8.5 g，按《中国药典》2010版一部附录ⅩD项下提取挥发油，分别提取两次(3、2 h)后将各自水提液合并浓缩至80 mL，分别加入挥发油(适量乙醇溶解)得浓缩液(生药含量为0.085 g·mL-1)，再加水至100 mL，备用(用前摇匀)。试验剂量按临床成人(60 kg)服用3 g计算[1]，小鼠给药剂量为0.43 g·kg-1。

3.2 方法

小鼠72只，雌雄各半，随机分成6组，分别为全果组、外果皮组、中果皮组、果瓤组、可立停组(按临床成人60 kg每次服用40 mL计算)和0.9%氯化钠溶液组。每组小鼠12只，抽取相应体积的药液，按20 mL·kg-1体重计算，用0.9%氯化钠溶液补至相应体积，灌胃给药，每天1次，连续给药4 d。于末次给药后1 h，将小鼠逐个放入玻璃钟罩内，以氨水(25%)喷雾引咳20 s，观察小鼠从喷雾开始到出现腹肌收缩张嘴的时间以及2 min内咳嗽次数，首咳时间超过90 s者，按90 s计[6-7]。药效实验数据用SPSS 10.0软件处理，方差分析比较各组之间的差异，P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 化州柚各部位黄酮类成分含量测定结果

化州柚各部位黄酮类成分含量的测定中，柚皮苷对照品与样品紫外光谱见图1，柚皮苷对照品与样品HPLC色谱见图2，测定结果见表1。在各部位中，总黄酮、柚皮苷含量大致相仿，以果瓤部位的含量最高。

注：A.柚皮苷；B.外果皮；C.中果皮；D.果瓤。图1 柚皮苷对照品与化州柚各部位紫外光谱图

注：A.柚皮苷；B.外果皮；C.中果皮；D.果瓤。图2 柚皮苷对照品与化州柚各部位HPLC图

表1 化州柚各部位黄酮类成分含量测定(n=3)

4.2 化州柚各部位的色谱指纹图谱结果

化州柚各部位的色谱指纹图谱见图3～7。应用国家药典委员会推荐使用的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以外果皮的指纹图谱为参比图谱，计算图谱之间的相似度，共标识13个共有峰，相似度计算结果见图8。外果皮、中果皮、果瓤、全果的相似度分别为1.000、0.937 7、0.896 3、0.972 3。

图3 柚皮苷和野漆树苷HPLC图

图4 化州柚全果HPLC指纹图谱

图5 化州柚外果皮HPLC指纹图谱

图6 化州柚果瓤HPLC指纹图谱

图7 化州柚中果皮HPLC指纹图谱

注：1.外果皮；2.果瓤；3.中果皮；4.全果；R.共有模式。图8 化州柚各部位相似度计算分析图

4.3 化州柚药效学研究结果

表2结果表明，外果皮组、中果皮组、果瓤组、全果组与空白组比较，均能延长小鼠咳嗽潜伏期和减少2 min内小鼠的咳嗽次数，差异具有统计学意义(P<0.05)；外果皮组与全果组、果瓤组、中果皮组间相互比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 化州柚各部位对小鼠的镇咳作用

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

5 小结与讨论

化州柚产于化州市，其果实为一种表皮密被绒毛的特有的柚。史上化州柚原被列入橘红项下，李中立的《本草原始》就载有：“橘红，广东化州者胜”；由于化州橘红质优效佳，之后才单列为化橘红。化州柚中果皮和果瓤分别占果实总重的34%和9%，《中国药典》2010版仅按照橘红类以果皮入药的方法，规定化橘红以外果皮入药，既有悖于化州柚传统入药方法，又浪费了化州柚中果皮和果瓤部分，不利于化州柚资源的利用。

本研究结果显示，外果皮与中果皮、果瓤的总黄酮、柚皮苷含量大致相仿；指纹图谱相似度软件计算结果显示各部位的指纹图谱具有较高的相似度，显示分散在果实各部位中黄酮类成分大致相同；药效学研究表明外果皮、中果皮、果瓤、全果均具有较强的镇咳效果，后三者与外果皮比较镇咳作用差异无统计学意义。表明化州柚以全果入药具有一定科学性与合理性。

本研究为充分利用化州柚资源、缓解道地药材的紧缺局面打下了坚实的研究基础，为后续的研究作了很好的开端，但仅对总黄酮化学成分及镇咳效果进行对比研究，有一定的局限性，作者拟继续开展挥发油化学成分，祛痰、抗炎等药效药理研究和急毒、长毒的毒理学研究，以及进一步以化橘红为君药的经典中药复方的药效学对比研究，力求更加全面地评价化州柚全果入药的科学性。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：69-70.

[2] 黄兰珍，梁照恒，林励，等.不同炮制方法对化橘红中柚皮苷含量的影响[J].中药新药与临床药理，2005，16(1)：59-61.

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StudyonMedicinalPartsofCitrusGrandis‘Tomentosa’

ZHANGQiuling1，WUBojian2，HUANGXiaodan2，CHENKang3，LINLi3*

(1.GuangzhouHospitalofTCM，Guangzhou510450，China；2.GuangzhouWanglaojiPharmaceuticalCompanyLimited，Guangzhou510450，China；3.GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Objectives：To study the exocarp，mesocarp and flesh ofCitrusgrandis‘Tomentosa’ for laying the foundation to make full use of resources.Methods：The total flavonoids content was determined by UV spectrophotometry.The naringin content and similarity of chromatographic fingerprint were determined by HPLC.Combined with the pharmacological index to the medicinal parts ofC.grandis‘Tomentosa’ was discussed.Results：The total flavonoids content and naringin content were similar in different parts ofC.grandis‘Tomentosa’.The similarity of chromatographic fingerprint of different parts was higher.All groups of exocarp，mesocarp，flesh and the whole fruit prolonged the cough incubation periodand and reduce the cough frequency in mice.There were no significant differences between all groups of them.Conclusion：There exists a certain scientific reasons for that the whole fruit ofC.grandis‘Tomentosa’ could be used as medicinal parts.

Citrusgrandis‘Tomentosa’；medicinal parts；total flavonoids；naringin；chromatographic fingerprint；antitussive；mice

2015-07-07)

国家发展和改革委员会发改高技(2003-26)

*

林励，研究员，研究方向：中药资源利用与新药开发；E-mail：13802914007@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.009