基于谱-效相关的雷公藤抗炎药效物质的研究△

董捷鸣，续畅，宫嫚，赵庆国，王伽伯，肖小河，马致洁*，浦仕彪，3*

(1.首都医科大学 附属北京友谊医院，北京 100050；2.解放军302医院 中西医结合研究中心，北京 100039；3.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650200)

基于谱-效相关的雷公藤抗炎药效物质的研究△

董捷鸣1，续畅1，宫嫚2，赵庆国2，王伽伯2，肖小河2，马致洁1*，浦仕彪1，3*

(1.首都医科大学 附属北京友谊医院，北京 100050；2.解放军302医院 中西医结合研究中心，北京 100039；3.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650200)

目的：基于谱-效相关分析方法，对雷公藤体外抗炎药效物质进行初步筛选。方法：运用LC-Q/TOF-MS技术表征不同产地雷公藤的化学成分并初步指认其成分；以小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)为模型，检测细胞上清液中的白介素-6和白介素-10及诱导性一氧化氮合成酶，评价雷公藤的体外抗炎效应。采用相关回归分析方法分析效应与成分之间的关系。结果：指认出雷公藤的10个有效成分；确认BMDM模型可以有效评价雷公藤体外抗炎效应，并通过简单及多元相关回归分析可知雷公藤甲素、雷公藤晋碱应对雷公藤抗炎效应有较大相关。结论：雷公藤晋碱可能与雷公藤抗炎效应相关性较高。

雷公藤；抗炎效应；谱-效相关；巨噬细胞；雷公藤晋碱

雷公藤是我国传统中药，素来有古方记载。最早出现在《神农本草经》之中，为卫矛科雷公藤属植物雷公藤的根，又叫黄腾、黄腊腾、红药、水莽草等[1]。雷公藤性寒，味苦，有大毒，以肝、肾、生殖器毒性最为显著[2-3]，但又因其在自身免疫疾病方面有着不可替代的治疗效果，广泛用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、系统性红斑狼疮等疾病[4-5]。

由于雷公藤在治疗自身免疫性疾病等难治疾病上的重要地位，使其成为研究的热点。但临床上总体治疗指数低，不良反应的发生率远高于其他药物。为保障临床应用的安全性和有效性，急待有效的质量控制方法[6-8]。目前雷公藤质量控制主要有测定总量、测定单一成分、测定多指标成分及指纹图谱等手段[9]。近年来，为了提高雷公藤质量控制水平，有研究者采用LC-MS/MS建立了同时测定雷公藤药材中雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤定碱、雷酚内酯5种活性成分的质控方法[10]。但由于雷公藤药效与毒性物质基础尚不明确，含量测定的指标性成分与药效、毒性的关联性不强，难以保证药材的安全性及有效性。本实验旨在拟结合近年来发展迅速的生物评价方法对雷公藤进行谱效相关分析，初步探索其抗炎物质基础，为雷公藤的质量控制提供参考。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Agilent Technology 1290 Infinity UPLC超高效液相色谱仪，Agilent Technology iFunnel 6550 LC-Q-TOF /MS四级杆串联飞行时间质谱，1290二极光阵列检测器(G4212A)；Gradient A10 Mill-Q 超纯水器(美国 Millipore公司)；微量分析天平(Mettler Toledo AL204，瑞士)；冷冻离心机(Sigma，德国)。

IX71型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；SynergyTMHT多功能酶标仪(美国BioTek公司)；AL204微量分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ZK-82B型真空干燥箱(上海市实验仪器总厂)；SG403A-HE生物安全柜(美国Baker公司)；恒温二氧化碳培养箱(美国NAPCO公司)。

1.2 材料

收集浙江、江西、安徽等23个不同地区的雷公藤干燥根，依次编号，样品信息见表1。所有样品均由首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科主任赵奎君教授鉴定为正品。

甲醇、乙腈(色谱级，德国Merck公司)，甲酸，去离子水，0.22 μm微孔滤膜(津腾)，其他试剂均为市售分析纯。

胎牛血清(美国Gibco，批号：16000-044)，DMEM培养基(美国Hyclone，批号：SH30022.01B)，青霉素/链霉素双抗溶液(SV30010，美国Hyclone)，胰蛋白酶(美国Gibco，批号：25200-056)，二甲基亚砜(DMSO，德国Sigma-Aldrich，批号：D2650)；柳氮磺吡啶肠溶片(山西晋新双鹤药业股份有限公司，批号：131102)；实验细胞选用小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)细胞系，购自中国科学院上海细胞所。

表1 23批雷公藤样品编号及产地信息

2 方法

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18600 Bar(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：A为CH3CN(含0.1% HCOOH)，B为H2O(含0.1% HCOOH)；流速：0.3 mL·min-1；进样量：4 μL；柱温：30 ℃；样品温度：4 ℃；检测波长：190～420 nm；色谱梯度洗脱条件为：1～8 min，A-B(95∶5)；9～18 min，A-B(60∶40)；19～25 min，A-B(0 ∶100)。

离子源：ESI；毛细管电压：4000 V；质/核比范围：m/z80～1000；脱溶剂气温度：225 ℃；脱溶剂气流量：11 L·min-1；雾化器压力：45 psi(1 psi=6.895 kPa)；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L·min-1；喷嘴电压：500 V。

2.2 指纹图谱样品的制备

取23批不同产地雷公藤样品干浸膏适量，精密称定，分别置于10 mL量瓶中，加50%甲醇水溶液10 mL-1，超声溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，配制成2 mg·mL-1(以生药量计)的供试品溶液。

2.3 基于Elisa法评价雷公藤提取物抗炎效应

雷公藤药物及柳氮磺吡啶作用BMDM细胞的IC50及给药时间已有相应实验作为参考[11]。

将BMDM细胞以1.5×106个/孔种于6孔板中，分别为正常组、柳氮磺砒啶阳性药组及23组雷公藤提取物。待细胞贴壁后，分别加入以雷公藤提取物及柳氮磺砒啶的半数抑制浓度(IC50)为质量浓度的各药含药血清，每孔200 μL。作用24 h后，分别取各孔上清液，-70℃储存备用。采用Elisa法对各上清液中的促炎因子白细胞介素(IL)-6、抑炎因子IL-10及促进巨噬细胞释放一氧化氮(NO)的诱导性一氧化氮合酶(iNOS)进行测定，具体步骤参照试剂盒。

2.4 数据统计分析

3 结果及分析

3.1 23批雷公藤指纹图谱

由图1可见不同地区雷公藤化学成分含量差异较大，为验证这些差异与其雷公藤产地是否有内在的相关性，我们采用SIMCA-P-11软件对23批药材的质谱数据进行了主成分分析(PCA)，寻找化学成分差异和产地之间的关系。

如图2所示，除了浙江金华的样品外，其余样品主要分在3个区域。产地特别接近的样品聚集较明显，但这种分布规律与产地之间无明显相关性，其原因可能与样品产地比较分散有一定关系，但从主成分分析结果可以佐证质谱表征的结果，即不同样品内在的化学成分差异较大。

图1 23批不同地区雷公藤指纹图谱

图2 不同产地雷公藤药材的PCA主成分分析

3.2 雷公藤指纹图谱指认10个主要成分

指纹图谱指认的雷公藤10个主要成分信息见表2。

表2 雷公藤指纹图谱指认的10个主要成分

3.3 各药提取物作用BMDM细胞的上清液中IL-6、IL-10及iNOS检测结果

由表3可知，IL-6组别中阳性药及各雷公藤提取物作用BMDM细胞24 h后，各组细胞上清液中IL-6的质量浓度均高于正常组(P<0.05)；而雷公藤提取物中，除江西萍乡、云南、河北安国、江西樟树、福建三明的样品外，其他样品上清液中IL-6的质量浓度均低于阳性药柳氮磺砒啶组(P<0.05)。

IL-10组别中可看出阳性药及各雷公藤提取物作用BMDM细胞24 h后，除浙江金华、湖南岳阳县、云南菊花药市、广西清平的样品外，其他样品及阳性药细胞上清液中IL-10的质量浓度均高于正常组(P<0.05)；而雷公藤提取物中，除上述样品外，其余样品细胞上清液中IL-10的质量浓度均高于阳性药组，其中贵州黔东南苗族侗族自治州剑河县、湖北通城、安徽毫州、福建三明市泰宁朱口镇神下村、福建三明市泰宁朱口镇垇头村、贵州黔东南苗族侗族自治州雷州县的样品与阳性药柳氮磺砒啶之间存在统计学差异(P<0.05)。

iNOS组别检测结果可看出，阳性药及各雷公藤提取物作用BMDM细胞24 h后，其细胞上清液中iNOS的浓度均高于正常组，其中阳性药及江西遂州、贵州黔东南苗族侗族自治州剑河县、湖南邵阳、湖南岳阳县、云南菊花药市、安徽毫州、北京、河北安国、福建三明市、贵州黔东南苗族侗族自治州雷州县的样品与正常组之间存在统计学差异(P<0.05)；而各雷公藤提取物的细胞上清液中iNOS的浓度均低于阳性药组，且除贵州黔东南苗族侗族自治州剑河县、湖南岳阳县、云南菊花药市、安徽毫州、河北安国、福建三明市泰宁朱口镇垇头村的样品外，其余各样品与阳性药柳氮磺砒啶之间均存在统计学差异(P<0.05)。

3.4 雷公藤主要成分与抗炎效应的简单相关及回归分析

为了独立考察各成分与抑炎因子IL-10检测水平之间的相关性，以各批次雷公藤对IL-10的影响水平为因变量Y，以雷公藤样品中主要的10个主要成分的质谱峰面积为自变量X1～X10，分别采用SPSS软件单独进行一元线性回归分析，相关分析全部采用Spearman简单相关进行研究。

表3 各雷公藤提取物作用BMDM细胞的上清液中IL-6、IL-10及iNOS检测结果 /pg·mL-1

注：与正常组相比，*P<0.05；与阳性药组相比，△P<0.05。

3.4.1 雷公藤甲素(X1)与IL-10(Y)的相关分析 以雷公藤甲素为例，由表4的X1与Y简单相关分析结果可知X1与Y的简单相关系数为0.269(P=0.215>0.05)，自变量X1与回归标准化预测值的散点图见图3。由图3可知雷公内酯醇相对含量与雷公藤抗炎效应没有明显的相关性，雷公藤甲素可能不是影响IL-10水平的成分。

表4 X1与Y的简单相关分析结果

图3 自变量X1与回归标准化预测值的散点图

3.4.2 雷公藤主要成分与抗炎效应的简单相关分析结果 所示元素均与IL-10做简单相关分析，结果见表5。简单相关分析结果显示表内成分均与雷公藤抗炎效应相关性不大，进一步采用多元相关分析。

表5 雷公藤中10个主要成分与抗炎效应简单相关分析总结果

3.5 多元线性统计相关方法的选择

由前述研究可知，IL-10可作为评价雷公藤抗炎效应的主要指标，为了寻找雷公藤主要成分与抗炎效应之间的关系，本研究使用SAS软件的多元相关分析探讨效应与成分之间的相关性。将雷公藤中10个主要成分定义为X1～X10作为自变量，炎症因子IL-10定义为Y作为因变量，建立雷公藤主要成分与抗炎效应IL-10的回归模型。

通过SAS软件进一步分析得到回归矩阵中各主成分特征及贡献率，10种成分中前4个变量累Z1～Z4计贡献率大于0.85。由表6可知，以P<0.05 为统计学差异水平时Z1、Z3两个主成分变量进入回归模型后，模型较好地拟合数据(F=7.01，P=0.015 4<0.05，r=0.460 1)。因此选择Z1、Z3两个主成分完成回归模型的建立。

表6 IL-10水平的主成分回归分析的参数检验结果

表7 参数检验结果

由表6、表7得到因变量Y在主成分上的线性回归方程，然后将主成分Z1、Z3的表达式代回到回归模型中，按照标准化公式将标准化变量转换为原始自变量，得到自变量Y与原始变量X1～X10的线性回归方程：Y=14.603 8+(18.464 900 77X1+8.622 035X2+2.432 968X3-308.006X4+2.727 914X5+16.242 98X6+6.200 643X7+1.159 044X8-1.345 01X9-93.225 4X10)×10-8。

通过主成分回归分析结果表明，拟合的回归模型中r=0.460 1，P=0.015 4<0.05，有统计学意义。由回归模型可知，X1、X6具有较大的参数值。

4 讨论与结果

阳性药柳氮磺砒啶可显著降低BMDM细胞上清液中IL-6及iNOS的质量浓度，且显著提高IL-10的质量浓度，从而表现出良好的抗炎效果。23批提取物中的许多样品表现出降低IL-6及iNOS的质量浓度、升高IL-10质量浓度的活性，而其中的安徽毫州药市的样品细胞上清液中的IL-6及iNOS的质量浓度显著低于柳氮磺砒啶的，而IL-10的质量浓度显著高于柳氮磺砒啶的，这表明该样品可显著抑制巨噬细胞分泌致炎因子IL-6，并显著促进巨噬细胞分泌抑炎因子，还能够通过抑制iNOS的分泌，从而减少NO的合成，其抗炎功效优于柳氮磺砒啶，表现出良好应用前景，可对其成分组成及作用机制进行进一步研究，从而为开发新一代抗炎药物提供思路。

通过抑炎因子IL-10与10种主要成分的简单相关分析，可初步确定10种主要成分与IL-10均无显著相关性；通过10种主要成分与抑炎因子IL-10的主成分回归分析，表明雷公藤甲素、雷公藤晋碱具有较大的参数值，说明雷公藤甲素、雷公藤晋碱可能对雷公藤抗炎效应有较大的贡献度。

为了增加临床应用的安全性和有效性，明确雷公藤的药效成分将是选取治疗效果更好、减少毒副作用危害的关键。本实验初步明确了雷公藤抗炎的药效成分，为临床用药提供了更好的选药依据。本实验仅进行了体外实验的研究，如结果得到进一步确认，仍需进行体内实验验证。

[1] 杨丽娜.雷公藤制剂的指纹图谱与抗炎细胞药效学研究[D].福州：福建中医药大学，2014.

[2] 黄郑隽，阙慧卿，朱惠，等.雷公藤甲素对生殖系统毒性的研究进展[J].药物评价研究，2013，36(3)：224-227

[3] 郭艳红，谭垦.雷公藤的毒性及其研究概况[J].中药材，2007，30(1)：112-117.

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StudyonEffectiveComponentsofRootsofTripterygiumwilfordiiBasedonSpectrum-effectRelationshipsAnalysis

DONG Jieming1，XUChang1，GONGMan2，ZHAOQingguo2，WANGJiabo2，XIAOXiaohe2，MAZhijie1*，PUShibiao1，3*

(1.BeijingFriendshipHospital，CapitalMedical，Beijing100050，China；2.IntegrativeMedicine，Center，302MilitaryHospital，Beijing100039，China；3.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica，YunnanUniversityofTCM，Kunming650200，China)

Objective：Based on the spectrum-effect relationships analysis，to study theinvitroanti-inflammatory effect of the roots ofTripterygiumwilfordiiHook.f.Methods：LC-Q/TOF-MS technology was used to characterize the chemical composition of the roots ofT.wilfordiisamples come from different regions.And macrophages(BMDM)as carrier，interleukin 6(IL-6)，IL-10 and nitric oxide synthase(NOS)as indicators，evaluating the anti-inflammatory effect of the roots ofT.wilfordiiinvitro.Results：Ten kinds of main components were identified.Bone marrow-derived macrophage(BMDM)as carrier was able to evaluate the anti-inflammatory effectinvitro.Through the simple and multiple regression analyses，triptolide and wilforgine could be the anti-inflammatory substances of the roots ofT.wilfordii.Conclusion：Wilforgine may be a higher effect component of the roots ofT.wilfordii.

TripterygiumwilfordiiHook.f.；anti-inflammation；spectrum-effect relationships；macrophages；wilforgine

2016-03-04)

云南省应用基础研究面上项目(2014FZ072)；北京友谊医院院启动项目(YYDQKT2014-20)；北京中医管理局项目(QN2014-18)；首都中医药研究专项(15ZY04)

*

马致洁，主管中药师，研究方向：中药肝毒性研究，Tel：(010)63138562，E-mail：13811647091@163.com；浦仕彪，博士，讲师，研究方向：肝病的中医诊疗研究，E-mail：pushi511@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.011