葛根素预防压力过载性心脏肥大的保护作用及机制

覃　华，张　琰，王四旺，王　茹*

(1.第四军医大学唐都医院药剂科,西安　710038；2.第四军医大学药学系,西安　710032)



葛根素预防压力过载性心脏肥大的保护作用及机制

覃华1，张琰1，王四旺2，王茹1*

(1.第四军医大学唐都医院药剂科,西安710038；2.第四军医大学药学系,西安710032)

目的 研究葛根素对心脏肥大大鼠的保护作用，并探讨其相关机制。方法将主动脉缩窄术(降主动脉结扎，aorticbanding，AB)所致心脏肥大的40只雄性SpragueeDawley大鼠(体质量80～100g)，分为阳性对照组 (control组)、假手术组(sham-operated，SO组)、葛根素组(Pue组)和雷帕霉素组(RAPa组)。检测各组经相应药物治疗后，腺苷酸活化蛋白激酶(5′-adenosinemonophosphatekinase，AMPK)的活性及自噬功能。同时，体外检测异丙肾上腺素和3-甲基腺嘌呤所致的心肌影响。结果葛根素组治疗3周后，大鼠明显恢复自噬；葛根素治疗6周后，有效地限制大鼠心脏细胞肥大和细胞凋亡。雷帕霉素组具有相似作用。体外研究，葛根素对异丙肾上腺素所致的H9c2细胞也具有类似的抗肥大和抗细胞凋亡作用。用3-甲基腺嘌呤预处理H9c2细胞，抑制自噬功能后，葛根素的保护作用被阻断。结论葛根素通过AMPK/mTOR信号途径，部分恢复细胞自噬功能，发挥抗心脏细胞肥大和抗细胞凋亡作用。

葛根素；心脏肥大；自噬；AMPK

自噬促进受伤蛋白质和溶酶体细胞器的降解，与心血管疾病相关[1-2]。葛根素作为葛根的主要生物活性成分，已通过中国国家食品药品监督管理局批准，临床用于治疗心血管疾病和其他疾病[3-4]。然而，葛根素预防心脏肥大的详细机制仍不清楚，尤其是葛根素通过调节自噬影响心脏肥大的机制。本文以动物实验为基础，进行了相关研究。

1　仪器与材料

1.1仪器苏木精-伊红(HE)和Masson三色染色试剂盒 (Baso公司，中国广东)；Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Bio-Rad，美国)；原位末端标记(TUNEL)染色试剂盒(Roche，美国)；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(eBioscience，美国)；IE33超声心动图系统(飞利浦公司)。1.2试药异丙肾上腺素(ISO，国药准字H50020020,西南药业股份有限公司);葛根素注射液(国药准字H20055928，山东华信制药集团股份有限公司);3-甲基腺嘌呤(3-MA，IPA1009-0010MG，上海前尘生物科技有限公司)；氯喹(CQ)试剂、Hoechst33342(Sigma-Aldrich公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐(DAPI，上海研拓生物科技有限公司)；注射用葛根素(浙江震元制药有限公司)；雷帕霉素(上海蓝木化工有限公司)；AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)或负链对照siRNA(Thermo公司)；LC3B抗体，抗体P62，Beclin1，AMPKα，Thr172,Thr389，p70S6激酶，4E结合蛋白1(Sigma-Aldrich公司)；Thr37/46，雷帕霉素哺乳动物靶点 (mTOR)，裂解半胱天冬酶-3(CellSignalingTechnology公司)；AlexaFluor®555 鬼笔环肽 (Invitrogen公司)。1.3动物动物实验符合美国国立卫生研究院实验动物指导原则。所有大鼠均由南方医科大学动物保健服务中心饲养。

2　方法

2.1造模及给药方法40只雄性SpragueeDawley大鼠(体质量80～100g)经主动脉缩窄术(降主动脉结扎，aorticbanding，AB)引起心脏肥大后，分为阳性对照组(control组)、假手术组(sham-operated，SO组)、葛根素组(Pue组)和雷帕霉素组(RAPa组)。其中，SO组进行假手术处理,注射同等体积的生理盐水，Pue组和RAPa组分别皮下注射葛根素(100mg·kg-1·d-1)或雷帕霉素(1.2mg·kg-1·d-1)。

大鼠每周经水合氯醛麻醉，记录超声心动图。

2.2器官质量和免疫组织学分析计算心脏质量指数(HW/BW)和左心室质量指数(LWm/BW)；用心肌细胞截面积评价左心室(LV)肥大程度；截面积染色(苏木精-伊红)后经光学显微镜检查并测量肌细胞面积；Masson三色染色评估纤维化。

组织或细胞溶解产物离心后收集上清液。用Bradford法测定蛋白浓度。利用Trizol试剂从左心室组织或H9c2细胞中提取RNA，进行实时逆转录聚合酶链定量反应。合成cDNA用以实时聚合酶链反应(PCR)分析。本研究中使用的PCR引物序列如下：18S，50-ACCGCAGCTAGGAATAATGGA-30，50-GCCTCAGTTCCGAAAACCA-30；ANP，50-GGGGGTAGGATTGACAGGAT-30，50-CTCCAGGAGGGTATTCACCA-30；b-MHC，50-CCTCGCAATATCAAGGGAAA-30，50-TACAGGTGCATCAGCTCCAG-30。

2.3体外细胞的培养和处理H9c2心脏成肌细胞培养在达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基中。融合度达50%～60%，用ISO(1μmol·L-1)或不同葛根素浓度(1，5，10，20和40μmol·L-1)进行处理。阳性对照组经雷帕霉素100μmol·L-1处理，培养在正常培养基中(包含ISO100μmol·L-1)。

用TUNEL染色法测量心肌截面细胞凋亡；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒用以检测H9c2细胞凋亡；GFP-LC3质粒转染H9c2细胞；GFP-LC3阳性自噬空泡量化计算自噬情况。

3　结果

3.1体内LC3B表达和AMPK抑制术后第2～3周，阳性对照组LC3B-Ⅱ降低，而p62蛋白增加，见图1A和1B；术后第6周，阳性对照组LC3B-Ⅱ增加显著多于SO组，p62蛋白显著少于SO组，阳性对照组的AMPK-Thr172磷酸化变化情况与LC3B-Ⅱ变化相似，见图1C和1D。

图1葛根素对体内自噬的影响

A.免疫分子在阳性对照组与假手术组的免疫印迹结果；B.阳性对照组与假手术组的相应免疫分子柱状图；C.免疫分子在4组的免疫印迹结果；D.4组的相应免疫分子柱状图

Fig.1Effectsofpuerarinonautophagyinin vivostudy

A.westernblotresultsofimmunemoleculesinpositivecontrolgroupandSOgroup；B.correspondinghistogramofimmunemoleculesinpositivecontrolgroupandtheSOgroup；C.westernblotresultsofimmunemoleculesinthe4groups；D.correspondinghistogramofimmunemoleculesinthe4groups

3.2葛根素通过激活AMPK恢复自噬术后第3周观察到阳性对照组AMPK-Thr172磷酸化减少。葛根素组治疗3周，LC3B-Ⅱ显著增加，同时p62蛋白下降。此外，葛根素组AMPK磷酸化增加。大鼠经雷帕霉素组治疗后，自噬变化情况与葛根素组相似。3.3葛根素预防心脏肥大和重构阳性对照组术后6周，未发现左心室功能受损，见图2A和2B。然而，肥厚性指标，如左心室后壁舒张末期厚度(LVPWd)、左心室后壁收缩末期厚度(LVPWs)、室间隔舒张末期厚度(IVSd)和室间隔厚度显著增加。葛根素组和雷帕霉素组以上指标显著降低，见图2C。苏木精-伊红染色发现，阳性对照组肌细胞染色截面积增多，而葛根素组和雷帕霉素组治疗后，染色截面积显著缩减，见图2D和2E。Masson染色证明，阳性对照组间质和血管周纤维化增加，葛根素组和雷帕霉素组治疗显著降低肌细胞面积和纤维化，见图2F和图2G。HW/BW和LVm/BW变化情况相似，见图2H。此外，阳性对照组ANP和β-MHCmRNA升高，葛根素组和雷帕霉素组显著降低，见图2I。

3.4葛根素保护心脏细胞凋亡相比SO组，阳性对照组术后6周心脏细胞凋亡明显增加，半胱天冬酶-3蛋白裂解增加，见图2J。SO组TUNEL-阳性细胞少于阳性对照组。葛根素组和雷帕霉素组少见心脏细胞凋亡，见图2K。

图2术后第6周AB诱导LV肥大和细胞凋亡

A.超声心动图；B.左心室功能；C.心脏结构指数；D.H&E染色；E.H&E染色；F.间质Masson染色，葛根素及雷帕霉素显著降低纤维化和肌细胞面积；G.血管周围Masson染色，葛根素及雷帕霉素显著降低纤维化和肌细胞面积；H.HW/BWa和LVm/BW；I：ANP和bMHC肥大相关基因定量逆转录PCR分析；J.阳性对照组半胱天冬酶-3蛋白裂解；K.葛根素组和雷帕霉素组心脏细胞凋亡

Fig.2EvidenceofattenuationofAB-inducedLVhypertrophyandapoptosisat6weeks

A.picturesofechocardiography；B.leftventricularfunction；C.indexesofcardiacstructure；D.H&Estaining；E.H&Estaining；F.Massontrichromestainingforinterstitialfibrosis，andbothpuerarinandrapamycintreatmentsignificantlyreducedmyocyteareaandfibrosis；G.Massontrichromestainingforperivascularfibrosisandbothpuerarinandrapamycintreatmentsignificantlyreducedmyocyteareaandfibrosis；H.HW/BWandLVm/BW；I.PCRanalysisofthehypertrophy-relatedgenesANPandbMHC；J.positivecontrolgroupcaspase-3proteincracking;k.cardiaccellapoptosisinpueraringroupandrapamycingroup

3.5自噬功能障碍与AMPK抑制体外研究用ISO处理H9c2细胞6h后，LC3B-Ⅱ和AMPK降低，见图3A；用ISO治疗H9c2细胞12h后，LC3B-Ⅱ增加，AMPK激活。

3.6葛根素恢复自噬活性体外研究发现，葛根素组与雷帕霉素组相似，预处理H9c2细胞24h后，再与ISO共同培养6h，LC3B-Ⅱ呈剂量依赖性增加，见图3B；葛根素可恢复siRNA转染的细胞LC3-Ⅱ水平，但不能恢复AMPK-Si转染的细胞LC3-Ⅱ水平，见图3C；氯喹预处理H9c2细胞16h，H9c2细胞中LC3B-Ⅱ增加，但此种效应能被ISO减弱。细胞经葛根素(20μmol·L-1)和CQ预处理，然后与ISO共同培养，增加GFP-LC3的数量。

3.7葛根素调节mTOR信号途径术后3周，阳性对照组mTOR磷酸化及其下游效应器S6K和4EBP1显著增加。葛根素组及雷帕霉素组治疗后，mTOR，S6K和4EBP1磷酸化明显减少，表明葛根素抑制mTOR磷酸化，从而恢复自噬活性。

图3葛根素对自噬及心肌细胞肥大的影响

A.异丙肾上腺素对H9c2自噬的影响；B.葛根素对自噬活性的影响；C.葛根素不同影响CsiRNA及AMPK-si转染的细胞自噬活性

Fig.3Effectsofpuerarinonautophagyandcardiomyocytehypertrophy

A.effectsofisoprenalineonautophagyinH9c2withtime；B.puerarinpretreatmentfor24hfollowedbyco-culturewithISOfor6h；C.differentinfluencesofCsiRNAandAMDK-sitransfectioncellautophagyactivitybypuerarin

4　讨论

研究结果证明，葛根素调控AMPK/mTOR信号途径，参与自噬激活，发挥减缓心脏肥大和抑制心脏细胞凋亡作用。目前的研究结果与前人数据一致，大鼠经葛根素治疗6周后，心脏肥大和细胞凋亡指标明显好转。同样，葛根素治疗也能降低ANP和β-MHCmRNA的表达，减缓ISO引发的H9c2细胞凋亡。心脏细胞应对各种各样的压力反应时，自噬可以发挥重要的作用[5]。先前的心脏肥大动物模型数据已经表明，自噬是维持心脏细胞形态和心脏功能的关键，可消除受伤的细胞器和蛋白质，但过度自噬却能诱导心肌细胞死亡[6]。然而，心脏持续过载诱发心力衰竭，过度激活自噬，最终导致心脏细胞死亡[7]。因此，自噬水平的变化可反映心脏肥大的不同阶段。

研究发现，雷帕霉素治疗大鼠，可有效减轻阳性症状，包括预防心脏肥大恶化、迟滞心肌重构、抑制心脏细胞凋亡和激活自噬。葛根素治疗可产生类似的效果。3-甲基腺嘌呤预处理H9c2细胞，葛根素未能降低肥大和凋亡指标。结果表明，葛根素的保护作用与自噬有关。

WangXC等[8]研究葛根素治疗帕金森病，证明葛根素能够防止活性氧的增加，通过分子伴侣介导的自噬途径，防止氧化损伤。其次，AMPK/mTOR信号途径可能参与自噬分子机制。已有数据表明，AMPK/mTOR信号参与心脏肥大的发展[9]。本文体内研究观察表明，AMPK磷酸化水平下降，伴随LC3-Ⅱ减少。

雷帕霉素抑制mTOR从而阻断p70S6K激活和心脏肥大。目前的研究中，葛根素抑制mTOR信号途径，显著降低S6磷酸化和4EBP1磷酸化。这表明葛根素对mTOR发挥抑制作用，同时诱导活化自噬。

研究结果表明，葛根素促进自噬，刺激AMPK磷酸化，抑制mTOR磷酸化，最终发挥抗心脏肥大效应。

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Protective effect and mechanism of puerarin prevent cardiac hypertrophy from pressure overload

QIN Hua1，ZHANG Yan1，WANG Siwang2，WANG Ru1*

(DepartmentofPharmacy，TangduHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi′an710038，China；DepartmentofPharmacy,theFourthMilitaryMedicalUniversity，ShaanxiXi′an710032，China)

ObjectiveTocertifytheprotectiveeffectsofpuerarinoncardiachypertrophyinrats，andtostudytherelatedmechanism.Methods40maleSpragueeDawleyrats(weight80-100g)withmyocardialhypertrophycausedbyaortasurgery(descendingaortaligation，aorticbanding，AB)，weredividedintothepositivecontrolgroup(con)，sham-operatedgroup(SO)，pueraringroup(Pue)andrapamycingroup(Rapa).Theactivatedproteinkinase(5′-adenosinemonophosphatekinase，AMPK)activityandthefunctionofautophagyweretested.Atthesametime,themyocardialeffectscausedbyisopropyladrenalineand3-methyladeninewerein vitrotested.ResultsAfter3weeks，theratstreatedwithpuerarinrecoveredautophagy.6weeksafterpuerarintreatment,themyocytehypertrophyandapoptosiswereeffectivelylimited.Rapamycingrouphadsimilarfunction.Inin vitrostudies，puerarinalsohadsimilarhypertrophyandapoptosisresistanceeffectsinH9c2cellspretreatedbyisopropyl.ButtheprotectionofpuerarinwasblockedinH9c2cellspretreatedby3-methyladenine.ConclusionAllthesedataindicatethatpuerarinexertsprotectiveeffectsagainstcardiomyocytehypertrophyandapoptosis，partlybyrestorationofautophagythroughAMPK/mTOR-mediatedsignaling.

puerarin；cardiachypertrophy；autophagy；AMPK

陕西省“13115”工程技术研究中心资助项目(编号:S2010ZDGC105)

覃华，女，主管药师

王茹，女，副主任药师

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.012

R965

A

1004-2407(2016)05-0478-05

2016-02-20)