苦豆子对大鼠学习和记忆的损伤作用

彭晓明，霍仕霞，窦　勤，闫　明，阿不都热依木·肉孜，高　莉

(新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所,新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐　830049)



·药理·

苦豆子对大鼠学习和记忆的损伤作用

彭晓明，霍仕霞，窦勤，闫明，阿不都热依木·肉孜，高莉

(新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所,新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐830049)

目的 探讨苦豆子对大鼠学习和记忆的影响。方法将48只SD大鼠随机分为正常组及苦豆子低、中、高剂量组。除正常组外，其余大鼠以80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉连续灌胃给药30d。给药完成后，利用Morris水迷宫、穿梭避暗测试仪和跳台记录仪测定大鼠的学习和记忆能力，化学比色法测定大鼠脑组织中的AchE活性。结果与正常组相比，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子可使水迷宫实验中大鼠的潜伏期显著延长，穿越平台的次数明显减少(P<0.05或P<0.01)；避暗实验中大鼠的错误次数明显增多，潜伏期显著缩短(P<0.05或P<0.01)；穿梭实验给药组大鼠的主动回避反应次数显著减少，主动回避潜伏期明显延长(P<0.05或P<0.01)；跳台实验给药组大鼠的下台潜伏期明显缩短，错误次数显著增加(P<0.01)。此外，苦豆子给药组大鼠脑组织中AchE活性也明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论120和160g·kg-1·d-1的苦豆子对大鼠学习和记忆具有损伤作用。

苦豆子；学习记忆；损伤

苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)是豆科槐属多年生草本药用植物，维吾尔语名为布牙，药用根、茎、全草及种子，主要分布在内蒙古、新疆、宁夏、甘肃和青海等干旱荒漠地区。苦豆子药性三级干寒，味苦，具有生干生寒、清热燥湿、止泻止痢和消炎镇痛等作用[1]。目前国内以苦豆子为原料研制开发的制剂有克泻灵片、妇炎栓、苦豆子总碱直肠栓、苦参素注射液、复方苦豆子口腔溃疡复合膜、苦豆子油擦剂和苦豆子乳膏剂等[2-3]。研究表明，苦豆子总生物碱和单体生物碱对实验动物中枢神经系统具有抑制作用[4]。曹晓东[3]发现，苦豆子总碱可引起小鼠脑组织神经细胞凝固性坏死。本实验利用不同浓度的苦豆子粉作用于健康大鼠，研究其对大鼠学习和记忆的影响，为苦豆子的临床安全用药提供依据。

1　仪器与材料

1.1仪器IVC独立送风隔离笼具(IVC-Ⅱ，苏州冯氏实验动物设备有限公司)；跳台记录仪(YLS-3TB，济南益延科技发展有限公司)；分析天平(BS224S，北京赛多利斯科学仪器有限公司)；避暗穿梭测试仪(YLS-17B，北京众实迪创科技发展有限责任公司)；Morris水迷宫视频分析系统(ZS-001，北京众实迪创科技发展有限责任公司)。

1.2试药苦豆子购自于新疆本草堂中药饮片有限公司，将药材粉碎，过120目筛。羧甲基纤维素钠为天津光复精细化工研究所产品。

1.3动物健康SD大鼠48只，雌雄各半，SPF级，体质量180～220g，购自新疆维吾尔自治区实验动物中心。2方法

2.1动物给药全部大鼠在IVC盒中适应性饲养7d，称取体质量，随机分成4组，即正常组及苦豆子粉低、中、高剂量组，每组12只。正常组大鼠灌胃40mL·kg-1·d-1质量浓度为5g·L-1的CMCNa，给药组分别给予80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉，连续给药30d。

2.2Morris水迷宫实验第26天，大鼠给药2h后选取每组6只大鼠进行水迷宫实验。水迷宫为一黑色圆形水池，直径120cm，高60cm，水深40cm，水温25±1 ℃，分为4个象限，其中一象限内水面下1.5cm处设置1个直径为20cm的平台。实验前在水中加入墨汁，避免动物直接发现平台。Morris水迷宫实验分为定位航行和空间搜索两部分：(1)定位航行实验：连续进行4d，每天训练4次。训练时，将大鼠面向池壁从4个入水点分别放入水池，记录大鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为潜伏期(latency)。大鼠找到平台后，让其在平台上站立5s。若入水后90s大鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留15s，然后进行下一次训练。(2)空间搜索实验：定位航行实验结束后，撤去平台，从4个入水点放入水中，测其第1次到达原平台位置的时间(潜伏期)和穿越原平台的次数(crossingtimes)。

2.3避暗实验第25天，给药2h后选取每组6只大鼠进行避暗实验。将大鼠背对洞口放入明室，暗室内电栅通电。大鼠天生喜暗怕明，其随后会进入暗室。但会受到暗室电击而退出，因此而产生暗室有电的短暂记忆。避暗实验将记录大鼠第1次进入暗室的时间为潜伏期，以及300s内进入暗室遭受电击的次数为错误次数，作为学习成绩。24h后重复测定1次，作为记忆成绩。

2.4穿梭实验第27天，给药2h后选取每组6只大鼠进行穿梭实验。大鼠放入一室适应2min，实验测试开始后，蜂鸣声和灯光信号持续10s，大鼠如果在10s内穿过通道进入二室，记为主动回避反应(activeavoidresponse，AV)1次，其所需时间称为主动回避潜伏期(activeavoidlatency，AVLAT)；大鼠如果在10s内不进入暗室，则受到持续10s的电击，受到电击进入对侧则记为被动回避反应(passiveescaperesponse，ESC)1次。以此循环20次，24h后重复测定。2.5跳台实验第29 天，大鼠给药2h后选取每组6只进行跳台检测。将大鼠放入跳台箱内适应环境3min，然后立即通以36V2mA的交流电。此时，大鼠为逃避遭受电击而跃上安全平台，开始计时并观察5min内受电击的次数(即错误次数)作为学习成绩。同时记录计时开始至大鼠走下平台遭受电击的时间，作为下台潜伏期，潜伏期超过300s，则以300s计算。24h后测试其记忆能力：将训练过的大鼠稳当地放于跳台上，通电并开始计时，记录开始至大鼠走下平台的时间(即潜伏期)，以及5min内大鼠走下平台遭受电击的次数(即错误次数)，作为记忆成绩，进行统计学检验[5]。

2.6大鼠脑组织中AchE活性的测定大鼠完成给药和行为学检测后，腹主动脉取血、处死。然后在冰上剥离脑组织并称定质量，加入9倍的生理盐水，匀浆，以3 500r·min-1离心10min，吸取上清液备用。利用南京建成生物工程研究所的AchE试剂盒和BCA试剂盒测定大鼠脑组织中的AchE活性，具体测定方法为：分别设置并标记测定管、对照管、标准管(3个)和空白管(3个)。在测定管中加入50μL的待测脑组织匀浆，标准管中加入50μL的1μmol·mL-1标准应用液，空白管中加入50μL的双蒸水，对照管不加。然后在所有管中加入500μL的底物缓冲液和500μL的显色应用液，混匀，37 ℃准确反应6min。反应完成后，依次在所有管中加入30μL的抑制剂、100μL的透明剂和50μL的稳定剂，同时在样品对照管中加入50μL的待测脑组织匀浆。混匀，室温放置15min，在全波长酶标仪412nm处测定吸光度值。计算大鼠脑组织中的AchE活性，脑组织AchE活力=(测定A值-对照A值)/(标准A值-空白A值)×对照品浓度÷待测样本蛋白浓度。

3　结果

3.1苦豆子对大鼠水迷宫实验的影响Morris水迷宫实验中的定位航行实验主要用于测试大鼠的学习能力，空间搜索实验用于检测大鼠的空间记忆能力，见图1。由图1可知，正常组和80g·kg-1·d-1的苦豆子给药组大鼠在水迷宫中游泳轨迹大多为趋向式，而120和160g·kg-1·d-1的苦豆子给药组大鼠游泳轨迹则为随机式，见表1。由表1可知，随着检测时间的增加，各组大鼠找到平台的时间(即潜伏期)逐渐缩短。与正常组相比，苦豆子各给药组大鼠的潜伏期显著延长(P<0.05或P<0.01)，穿越平台的次数明显减少(P<0.05或P<0.01)。

表1苦豆子对大鼠在Morris水迷宫中寻台潜伏期(s)及末次穿台次数的影响

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01。

图1大鼠在Morris水迷宫中的游泳轨迹图

A．正常组；B．80g·kg-1·d-1苦豆子；C．120g·kg-1·d-1苦豆子；D．160g·kg-1·d-1苦豆子

Fig.1TheswimmingtrackgraphsofratsinMorriswatermazeA．normalgroup；B．Sophora alopecuroidesL.(80g·kg-1·d-1)；C．Sophora alopecuroidesL.(120g·kg-1·d-1)；D．Sophora alopecuroidesL.(160g·kg-1·d-1)

3.2苦豆子对大鼠避暗实验的影响避暗实验是利用动物怕明喜暗的生理特性来检测动物学习记忆的方法。动物在进入暗室过程中的错误次数和潜伏期可反映动物的学习记忆能力。与正常组比较，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子给药组大鼠的错误次数比正常组明显增多(P<0.05或P<0.01)，进入暗室的潜伏期也显著缩短(P<0.05或P<0.01)。见表2。

3.3苦豆子对大鼠穿梭实验的影响穿梭实验是一种检测联想记忆的经典方法，动物从被动逃避到主动逃避的学习过程(即主动逃避潜伏期)越短，表明其记忆能力越强。与正常组比较，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子给药组大鼠主动回避反应次数显著减少(P<0.05或P<0.01)，且主动回避潜伏期明显延长(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表2苦豆子对大鼠在避暗测试仪中潜伏期和错误次数的影响

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01。

表3苦豆子对大鼠在穿梭测试仪中主动回避、被动回避次数及主动回避潜伏期的影响

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01。

3.4苦豆子对大鼠跳台实验的影响跳台实验常用于评价动物被动回避的学习记忆能力，被测动物的下台潜伏期缩短或错误次数增加，均可直接反映其记忆能力是否受到损伤。与正常组比较，大鼠经苦豆子给药30d后，其下台潜伏期明显缩短(P<0.05或P<0.01)，错误次数显著增加(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4苦豆子对大鼠在跳台记录仪中潜伏期和错误次数的影响

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01。

3.5苦豆子对大鼠脑组织中AchE活性的影响AchE(乙酰胆碱酯酶)是神经递质Ach(乙酰胆碱)的水解酶，其活力可间接反映Ach含量及胆碱能神经功能的情况。与正常组相比，苦豆子各给药组大鼠脑组织AchE活性均显著提高(P<0.05或P<0.01)。见表5。

表5苦豆子对大鼠脑AchE活性的影响

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01。

4　讨论

苦豆子在我国尤其是西北地区产量大，分布极广，资源丰富，是一种重要的植物资源。苦豆子化学成分主要以生物碱为主，其地上部分含生物碱6.1%～8.03%，种子约含生物碱8.11%[6]。目前，从苦豆子中已分离鉴定的生物碱主要有苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱和苦豆碱等20多种[7]。研究发现，苦豆子生物碱在抗肿瘤、抗菌、抗心律失常、抗乙肝和免疫等方面具有重要的药理活性和应用前景。但由于苦豆子全草有毒，人口服15粒以上种子即出现头晕、呕吐、烦躁和心悸等不适反应，且苦豆子中的氧化槐定碱和氧化苦参碱均具有中枢抑制作用，因此苦豆子对机体神经系统的影响值得关注。神经系统与机体其它器官系统联系广泛，且反应迅速，其与药物接触后，神经系统受损的表现会较早出现，因此神经毒性的评价对于药物早期毒性发现、保障药物安全应用有着非常重要的意义[8]。神经行为可以在整体、动态和网络调控的内涵下，关注药物对神经系统的损伤评估与预测，并可以此为指征确定毒性药物的阈剂量。

本实验利用80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉连续30d灌胃大鼠，与正常组大鼠比较，水迷宫实验给药组大鼠的潜伏期显著延长，穿越平台的次数明显减少；避暗实验给药组大鼠的错误次数明显增多，潜伏期显著缩短；穿梭实验给药组大鼠的主动回避反应次数显著减少，主动回避潜伏期明显延长；跳台实验给药组大鼠的下台潜伏期明显缩短，错误次数显著增加。此外，苦豆子给药组大鼠脑组织中的AchE活性均显著提高。乙酰胆碱(Ach)是中枢神经系统的主要神经递质之一，与学习记忆密切相关。AchE是Ach的水解酶，其活力可间接反映Ach的含量及胆碱能神经功能的情况。综上所述，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子对大鼠的学习和记忆具有损伤作用，可能与提高AchE活性、加速Ach的降解有关。

[1]新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所.中华本草-维吾尔药卷[M].上海：上海科学技术出版社，2005：212.

[2]杨巧丽，顾政一，黄华.中药苦豆子的研究进展[J].西北药学杂志，2011，26(3)：232-236.

[3]曹晓东.苦豆子总碱的毒性及HPLC法测定绵羊血浆四种苦豆子碱的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2014.

[4]邱天尧，赵宏英.苦豆子类生物碱的药理作用研究[J].黑龙江医药，2007，20(5)：508-509.

[5]石富国，兰洲，刘继平，等.当归芍药散二氯甲烷提取部位对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响[J].西北药学杂志，2012，27(2)：128-130.

[6]高红英，李国玉，王航宇，等.新疆苦豆子种子中生物碱类化学成分的研究[J].石河子大学学报：自然科学版，2011，29(1)：75-78.

[7]李艳艳，冯俊涛，张兴，等.苦豆子化学成分及其生物活性研究进展[J].西北农业学报，2005，14(2)：133-136.

[8]袁伯俊，廖明阳，李波．药物毒理学实验方法与技术[M].北京：化学工业出版社，2007：459.

The damage effect of Sophora alopecuroides L.on learning and memory of rats

PENG Xiaoming，HUO Shixia，DOU Qin，YAN Ming，Abduriyim ROZI，GAO Li*

(InstituteofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，PrescriptionLaboratoryofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，Urumqi830049，China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofSophora alopecuroidesL.onlearningandmemoryofrats.Methods48SDratswererandomlyassignedintocontrolgroupandSophora alopecuroidesL.group.Exceptfornormalgroup，ratsweretreatedbydifferentconcentrations(80，120and160g·kg-1·d-1)ofSophora alopecuroidesL.for30days.ThelearningandmemoryofratsweredetectedbyMorriswatermaze，shuttlebox，stepthroughtestandstep-downtest，andtheactivityofAchEinbrainofratswasmeasuredbychemicalcolorimetry.ResultsComparedwithnormalgroup，120and160g·kg-1·d-1ofSophora alopecuroidesL.couldprolongthelatencyanddecreasethecrossingtimesofratsinMorriswatermaze(P<0.05orP<0.01)，anditalsodecreasedtherat’slatencyofenteringdarkcabinandthenumberofactiveavoidresponseinshuttleboxandstepthroughtest(P<0.05orP<0.01).Moreover，Sophora alopecuroidesL.couldincreaseerrortimesofratsinstep-downtest(P<0.01)andtheactivityofAchEinbrain(P<0.05orP<0.01).Conclusion120and160g·kg-1·d-1ofSophora alopecuroidesL.havesignificantlydamageeffectsonlearningandmemoryofrats.

Sophora alopecuroidesL.；learningandmemory；damage

新疆维吾尔自治区科技支疆项目(编号：201491174);新疆维吾尔自治区公益性科研院所基金项目(编号：KY2015140)

彭晓明，男，硕士，副研究员

高莉，女，副研究员

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.011

R965

A

1004-2407(2016)05-0474-04

2015-12-10)