新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定*

郭明星，陈浩宇，梁　璐，张常娥

(广州医科大学病理生理学教研室，广东 广州 511436)



新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定*

郭明星，陈浩宇，梁璐，张常娥**

(广州医科大学病理生理学教研室，广东 广州 511436)

目的 建立一种简单、高效、稳定的海马神经元原代培养方法，以获得高纯度、高活力的海马神经元。方法 24h内新生鼠，用含B27的Neurobasal无血清培养基培养，显微镜下观察神经元的生长状态，MTS法测定不同时间神经元细胞的活力，并用Tau-1和MAP-2抗体鉴定海马神经元的纯度。结果 ①接种24h后，细胞完全贴壁，可见双突起和多个突起的神经元；72h后，海马神经元胞体饱满，立体感较强，突起之间相互形成突触联系，神经元极性完全建立；5～6d的神经元，突起形成密集的神经纤维网络。②MTS法测定结果显示，在培养1～8d时间内，海马神经元随着培养时间的延长，活力增加，第8d细胞活性到达高峰，继续培养时，活力开始下降。③Tau-1和MAP-2免疫荧光检测神经元，海马神经元纯度达到(85.5±5.4)%。结论 本实验方法简单易行，神经元纯度高、细胞活性好，且体外存活时间长，是神经疾病体外研究的良好细胞模型。

海马神经元；无血清原代培养；方法；优化与鉴定

在神经系统研究领域内，体外培养神经元细胞是研究神经元功能以及病理、生理变化的重要手段之一，在现代医学和神经科学中被广泛应用。原代神经元[1]直接来源于动物脑组织，在形态和生理功能上都能较好的模拟动物的体内细胞，得出的数据结果更加真实可信，与神经细胞系相比，它们能提供准确的生物学信息，并且它具有机体干扰少，影响因素单一，结果容易分析等优点。因此，神经元原代培养[2]常用于细胞和分子生物水平，研究神经元的生理、药理以及神经元突触相互作用的研究。

脑组织中的海马属于大脑的边缘系统，是个相对独立的结构，便于识别与取材，同时神经元种类相对单一，因此海马神经元的体外培养模型，被广大研究者当作理想的细胞模型。国内报道的大鼠海马神经元的培养方法有很多，但如何得到纯度高、活力好和体外存活时间长的神经元仍然是一个热点问题。本文通过参考多种文献，对现有的原代培养方法进行改良，优化新生大鼠海马神经元原代培养的方法，实验操作更加简单易行，体外存活时间长且纯度高，为神经系统的相关研究提供良好的细胞培养方法。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物新生24h内的SPF级SD大鼠，体质量(6.0±0.5)g，雌雄不限，由广东省实验动物中心提供[生产许可证编号：SCXK(粤)2013-0002]。

1.1.2药品及主要试剂DMEM/F12(1∶1)培养基和胎牛血清(FBS)、Neurobasal培养基、B27 培养基添加剂、GlutaMAX supplement(100X)、0.25%胰酶(含EDTA、酚红)、青链霉素(Gibco 公司)，小鼠抗Tau-1单克隆抗体(Millipore公司)，兔抗MAP-2多克隆抗体(Abcam公司)，小鼠抗GFAP单克隆抗体(CST 公司)，Alexa Fluor®Green 488-conjugate goat anti-mouse IgG (H+L)、Alexa Fluor®Red 594-conjugate goat anti-rabbit IgG (H+L)、DAPI(life公司)，多聚赖氨酸(PDL)(Sigma公司)，MTS试剂盒普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

1.1.3主要仪器恒温CO2细胞培养箱(Thermo，USA)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(Nikon ECLIPSE TS100，Japan)，荧光倒置显微镜(Leica，Germany)，酶标仪(Sunrise-Basic TECAN)，台式低温离心机(Eppendorf，Germany)。

1.1.4主要溶液的配制①D-hanks液(1L)：KCl 0.4g、NaCl 8.0g、Na2HPO4·12H2O 0.132g、KH2PO40.06g、NaHCO30.35g，分别称取以上各种药品溶于1LddH2O中，调pH值为7.0～7.2，无菌滤膜过滤，101.3kPa，120℃高压灭菌20min，储存于4℃冰箱备用。②多聚赖氨酸(PDL)溶液：PDL粉末用D-hanks液配成0.1mg/mL浓度，无菌滤膜过滤。③完全培养基配制(100mL)：DMEM/F12(1∶1)培养基89%、FBS 10%、青链霉素1%。④维持培养基配制(100mL)：Neurobasal Media 96%、B27 2%、青链霉素1%、GlutaMAX 1%。

1.2方法

1.2.1细胞培养板的预处理12孔塑料培养板放入细胞爬片，用0.1mg/mL浓度的PDL包被细胞爬片1h或4℃包被过夜，用前用灭菌好的ddH2O浸洗3次，D-hanks 液清洗1次，超净台晾干后，备用。

1.2.2细胞培养

(1)取材。取出生24h内的SD大鼠经75%乙醇浸泡、消毒，直接断头取脑置于D-hanks平皿中，冰上剪开皮肤和颅骨，钝性分离出脑组织，完整取出“新月形”海马组织，仔细去除脑膜和血管，快速将海马剪碎呈1mm×1mm×1mm大小。

(2)消化及离心。0.25%胰酶消化，37℃培养箱中孵育10min，同时每隔5min摇晃平皿一次，10min后取出青霉瓶，弃掉胰酶，然后再重新加入等体积新的胰酶，培养箱中继续孵育5min；组织呈粥糜状时，加入含10% FBS 完全培养基终止消化，经充分吹打，200目筛网过滤。收集过滤后的细胞以1000 r /min离心5 min，弃上清，加入Neurobasal无血清维持培养基，制成单细胞悬液。

(3)细胞计数。0.4%台盼蓝染色计数活细胞，将稀释好的细胞悬液滴于盖玻片和计数板的交界处，在3min内，分别计数活细胞和死细胞。计算四大格中细胞的总数，压线细胞只计左侧和上方的。计算公式如下：细胞密度(个/mL)=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数。

(4)细胞接种。调整悬液的细胞密度为3.5×105/mL，混匀最后稀释好的细胞悬液，接种到12孔板中，每孔200μL细胞悬液，放入饱和湿润细胞培养箱培养。3h后12孔板每孔补加800μL维持培养基继续培养。

(5)细胞换液。提前将维持培养基(Neurobasal 96%、B27 2%、GlutaMAX 1%、青链霉素1%)置于培养箱中孵育。细胞培养24h后漂洗并更换维持培养基，此后每3d维持培养基半量换液。

1.2.3神经元形态学观察倒置显微镜观察海马神经元在不同时间段的形态学变化并拍照，比较观察细胞的生长状态和突起的形成。

1.2.4神经细胞活性检测按(2～3)×105/mL的细胞密度，将100μL细胞悬液接种于96孔板中，用MTS试剂盒检测培养1d、2d、3d……12d的神经细胞活性。用酶标仪检测波长在490 nm的吸光度值(OD值)，OD值越高说明细胞活性越大，实验重复3次，每次5复孔，以OD值为纵坐标绘制海马神经元生长曲线。

1.2.5神经元纯度的鉴定神经元培养第3d弃去培养液；冷4%多聚甲醛固定15min；1% TritonX-100(PBS配)破膜15min；5% BSA封闭1h后滴加小鼠抗Tau-1单克隆抗体(神经元轴突的Ⅰ抗，1∶200)，兔抗MAP-2多克隆抗体(神经元树突的Ⅰ抗，1∶200)4℃过夜，鼠抗GFAP单克隆抗体(神经胶质细胞特异性Ⅰ抗，1∶300)；滴加相应的荧光Ⅱ抗室温避光孵育1h(免疫细胞双标时两种荧光Ⅱ抗同时加入，Ⅱ抗用5% BSA稀释)；DAPI复染细胞核15min，甘油封片后镜下观察。阴性对照用0.01mol/L PBS代替Ⅰ抗，其余步骤同上。神经元纯度计算：每张细胞爬片随机选取15个200倍视野，计数荧光细胞数，取平均值，分别计算神经元和神经胶质阳性细胞占全部细胞核总数的百分比，即为阳性神经元的纯度。

2　结　果

2.1海马神经元形态学观察结果海马神经元种植3h后，少部分细胞贴壁，单个均匀分布，折光性强；培养6h后，细胞表面可呈现单个或者多个层状伪足，胞体可见明显光晕；培养12h后，大部分细胞贴壁，多数神经元出现无分支的突起；神经元培养24h后，细胞生长状态良好，可以看见细胞完全贴壁，可见双突起和多个突起的神经元，其中一个突起迅速成为轴突，此时给细胞全量更换无血清培养基后，背景干净，无杂质；培养48h后，突起开始慢慢生长，部分突起发展成为树突；培养72h后，海马神经元生长状态很好，胞体饱满多数呈圆形、锥形，周围光晕明显，立体感较强，胞浆丰富，轴突增长增粗，其它的突起发展成为树突，并且相互之间形成突触联系，神经元极性完全建立。整个培养过程，未用阿糖胞苷处理，背景干净，无杂质，此时给细胞半量更换无血清培养基，以补充细胞所需营养。神经元培养4d后，神经元状态仍很好；培养5～6d后，细胞体积变大，胞浆丰富，胞体较前更饱满，细胞呈三角形，梭形和不规则形，立体感及折光性强，突起极其发达，互相连接，形成密集的神经纤维网络，背景干净，见图1。

图1　原代大鼠海马神经元在不同时间的细胞生长状态(×200,比例尺=50μm,n=3)

2.2海马神经元生长曲线经MTS试剂盒检测海马神经元的生长状态，确定海马神经元的成熟时间和进行后续实验的最佳时间。结果显示，在培养1～8d时间内，海马神经元随着培养时间的延长，活力增加，第8d细胞活性到达高峰；继续培养时，细胞活力开始下降，生长逐渐缓慢，开始出现老化现象，见图2。通过该实验可以确定，海马神经元培养至第7～8d，细胞成熟，可以用来做相关的药物和机制研究。

图2　海马神经元生长曲线图(n=3，N=5)

2.3神经元的纯度鉴定为了检测培养的神经元，用神经元特异性的抗体Tau-1和MAP-2，对培养3d的海马神经元细胞进行免疫荧光实验，Tau-1主要存在于胞体和轴突，呈现绿色荧光；MAP-2主要存在于胞体和树突，显示红色荧光，二者共同显色可以确定细胞类型为神经元细胞。DAPI标记细胞核，呈蓝色荧光。神经胶质细胞不着色，阴性对照未见细胞着色。同时，从结果可以确定Tau-1和MAP-2单独应用可以确定神经元，见图3A(封三)。

为了进一步鉴定神经元的纯度，并计算神经元和胶质细胞所占的百分率，用MAP-2和星形胶质特异性的抗体GFAP进行免疫荧光实验，通过计数神经元和神经胶质的荧光细胞数，和总的细胞核数相比，可分别算出神经元和胶质细胞的百分比，神经元的纯度约为(85.5±5.4)%，神经胶质细胞的比例为(10.0±4.3)%，见图3B(封三)。

3　讨　论

海马是神经元相对独立的脑组织，涉及学习、记忆和情感反应等高级神经活动，适合神经元多方面的研究[3]。因此海马神经元的原代培养应用十分广泛，但是，神经元在体外培养的死亡率较高，究其原因可以归纳为两类：一是无血清培养时，神经元所需的营养成分不够，神经元生长状态不好[4]，二是有血清培养时，需要添加阿糖胞苷或5-氟尿嘧啶脱氧核苷来抑制胶质细胞生长的同时也会损伤神经元[5]。因此，在海马神经元的培养过程中，如何提高神经元的纯度和活力，一直是广大研究者面临的难题。

目前海马神经元的原代培养方法种类繁多。主要包括有血清培养基培养[6]、无血清培养基培养[7]、以及先用有血清培养基培养，几小时或者24h后更换无血清培养基[8]培养。目前比较推崇无血清培养的方法，它又包括DMEM/F12培养基培养和Neurobasal培养基培养[9]。本研究采用进口的Neurobasal无血清培养基，并添加了无血清添加剂B27，可促进神经元生长，延长神经元存活的时间。经过MTS测定不同时间点海马细胞的活力，发现此种无血清的Neurobasal加B27培养海马神经元细胞，细胞生长状态好，性质稳定，效果很好。神经元的纯度高，可达(85.5±5.4)%。

本实验汲取过去研究者的经验[10，11]，并结合本实验的一些改良及经验，对海马神经元的原代培养进行了以下总结：①实验选取出生24h内新生鼠，可以不伤害孕鼠，节约资源，简便经济。且新生24h内新生鼠的脑组织方便固定，容易取材。②控制温度和时间：整个取材过程需要在冰袋上进行，并且所取海马组织置于冷的D-hanks液中，降低细胞代谢率，维持细胞充分的活力；同时取材过程速度要快，每只新生鼠操作时间控制在3～5min，总的时间控制在60min内，以防操作时间过长造成神经元失去活力甚至死亡。③剪碎海马组织时，需将其尽量快速剪碎呈1mm×1mm×1mm大小，以减少胰酶消化的时间。④胰酶消化组织时，注意控制胰酶的浓度和消化时间，将其放入37℃培养箱，先消化10min，轻轻摇晃组织，使其充分消化，然后弃掉胰酶，再加入新鲜的胰酶消化5min，以缩短胰酶消化时间并减少胰酶对细胞的损伤。⑤机械分离时注意吹打的力度和次数，尽量减少机械吹打对细胞造成的损伤，同时应尽量制成单细胞悬液，减少离心时间和转速。⑥神经元为贴壁培养细胞，必须粘附于固相表面才能生存，多聚赖氨酸包括左旋多聚赖氨酸(PLL)和右旋多聚赖氨酸(PDL)，而PLL会损伤细胞，因此我们采用分子量为7～15万的PDL，包被细胞爬片和培养皿，以增加海马神经元的贴壁率。⑦接种前：充分混匀细胞，先接种200μL细胞悬液；接种后：放入培养箱培养3h后，每孔补加800μL无血清培养基继续培养。此方法既可以减少接种细胞液的用量，又可以缩短细胞至玻片的距离，使细胞更容易贴壁。⑧整个培养过程均采用无血清培养方法，未使用阿糖胞苷或5-氟尿嘧啶脱氧核苷，避免对神经元造成损伤。我们所用的Neurobasal无血清培养基为神经元专有培养，另外添加B27神经生长因子，可以选择性促进神经元生长，而抑制胶质细胞生长。

Tau-1是微管相关蛋白，主要存在于神经元的胞体和轴突，MAP-2是微管蛋白，存在于神经元的胞体和树突，该两种蛋白不存在神经胶质细胞中。因此，以这两种蛋白抗体进行免疫荧光，计数神经元细胞的百分率，该方法可靠。GFAP为星形胶质细胞特异性抗体，可以观察和计数星形胶质细胞百分比，通过该实验进一步鉴定神经元的纯度。

综上所述，本实验方法可获得高活力、高纯度的海马神经元；方法简单，所培养的细胞能够建立神经纤维网络，形成有效的突触联系；为神经细胞的相关研究确定了原代神经元细胞的培养方法。

[1]Kaech S,Banker G.Culturinghippocampal neurons[J].Nat Protoc,2006,1(5):2406

[2]Lu H,Pang W,Hu YD,et al.Effects of intracellular zinc depletion on the expression of VDAC in cultured hippocampal neurons[J].Nutr Neurosci,2011,14(2):80

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Optimization and Identification of Primary Culture Method of Neonatal Rat Primary Hippocampal Neurons

GUO Ming-xing,CHEN Hao-yu,ZHANG Chang-e，et al

(DepartmentofPathophysiology,GuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouGuangdong511436,China)

Objective To establish an applicable and highly efficient method for primary culture of hippocampal neurons in order to obtain pure and vital hippocampal neurons.Methods 24h-new-born rats' hippocampal neurons were cultured by using serum-free Neurobasal cell culture (containing B27).The microscope was used to observe the situation of neuronal growth.MTS method was used to assay vitality of hippocampal neurons at different time.Tau-1 and MAP2 antibody were used to investigate purity of hippocampal neurons.Results ①Neuron cells completely attached wall in 24h after being cultured,and bipolar,multi-polar neurons were also observed.72h later,hippocampal neurons showed fully extended,round cell body,and multiple connections with other neuron cells,which suggested that the polarity of neurons was fully formed.5-6 days later,neuronal cells formed complicated nerve fibre network.②Results of MTS assay showed that hippocampal neurons grew more vital at prolonged 1-8 days of culturing time,reached peak on the 8th day,and decreased vitality later.③Immunofluorescence assay of Tau-1 and MAP2 showed that the purity of hippocampal neurons reached(85.5±5.4)%.Conclusion Our method is manageable and practicable in founding high-purity,high-vitality neuron.

Hippocampal neurons;Serum-free primary cell culture;Methods;Optimization and evaluation

国家自然基金(81170608)，广东省自然基金号(9451018201003604)

R329

A

2095-4646(2016)04-0284-05

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.04.0284

2016-05-20)

**通讯作者，E-mail：zhche86@163.com