银杏叶提取物对肠缺血再灌注肝损伤的保护作用

曾婷婷，刘　花，高　卉*

(1.湖北科技学院，湖北 咸宁 437100；2.武汉市江夏区第一人民医院)



银杏叶提取物对肠缺血再灌注肝损伤的保护作用

曾婷婷1，刘花2，高卉1*

(1.湖北科技学院，湖北 咸宁 437100；2.武汉市江夏区第一人民医院)

目的 观察银杏叶提取物(EGb)对大鼠肠缺血再灌注肝损伤的保护作用。方法 选择健康雄性SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只。分别为正常组、模型组、EGb小剂量组、EGb大剂量组。检测血清中ALT和AST，观察肝组织病理学改变，用Western blot检查肝组织芳香烃受体(AhR)。结果 大鼠在肠缺血再灌注后，血清中ALT和AST含量显著升高；肝组织中AhR的表达量显著增加；光镜下，肝组织的中央静脉和肝血窦淤血严重，局部坏死。EGb大剂量组与模型组比，ALT和AST水平明显下降，AhR的表达明显受到抑制，肝组织的淤血情况明显减轻。结论 银杏叶提取物对肠缺血再灌注肝损伤有保护作用，其可能的机制是通过抑制AhR的表达来发挥作用。

肝损伤；银杏叶提取物；芳香烃受体

肠缺血再灌注损伤是临床外科常见的组织器官损伤之一，在很多生理病理情况下都容易遭受缺血性损伤，这样可导致其它的器官损伤，其中以肝脏损伤较为常见。银杏叶提取物(Ginkgo Biloba leaves extract，EGb)是广泛存在我国的一种天然药物，有抗氧化、调节循环系统、保护组织等作用。因此，我们用EGb干预，开腹结扎肠系膜上动脉(SMA)，制备肠缺血再灌注肝损伤(I/R)的模型，观察血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST)和肝组织中芳香烃受体(AhR)的变化，探讨EGb对肠缺血再灌注肝损伤的保护作用。

1　材料与方法

1.1材料与试剂32只体质量为180～220g的健康雄性SD大鼠，舒血宁注射液(黑龙江珍宝岛药业有限公司生产，批号：国药准字Z23022004)，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，HRP标记山羊抗大鼠，BCA蛋白浓度测定试剂盒等。

1.2动物分组和给药[1]选健康雄性SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只。分别为正常组、模型组、EGb小剂量组(20mg/kg)、EGb大剂量组(60mg/kg)。大鼠术前禁食12～16h，禁水2h。术前称体质量，10%水合氯醛0.35L/kg腹腔注射麻醉，待麻醉生效后，给药组在肠系膜上动脉夹闭前1h阴茎背静脉给药，EGb小剂量组阴茎背静脉注入舒血宁注射液(20mg/kg)、EGb大剂量组(60mg/kg)取上腹部正中切口约2cm，按层进腹，采用Megison法制作肠缺血再灌注模型[2]，分离SMA，用无创型小血管夹将SMA根部夹闭，待SMA远端搏动消失，肠系膜由粉红变为苍白，动脉夹夹闭后，肠管还纳腹腔，缝合腹部切口。正常组仅行开腹及分离，不行夹闭肠系膜上动脉。模型组不给药，开腹分离后夹闭SMA30min，开放动脉夹60min，EGb小剂量组和EGb大剂量组给药后再夹闭SMA30min，开放动脉夹60min。

1.3主要实验步骤和检测指标①经下腔静脉取血5mL左右置于试管，室温静置20min左右，以3000rpm离心15min，取上清液，分装标记后置于-60℃冰箱备用，采用日本东芝全自动生化仪检测血清的ALT和AST。②取肝组织的右叶剪小置于10%中性甲醛固定液中固定24h后制作石蜡块，用来做HE染色，观察肝组织形态学的改变。③肝左叶剪齐，分装，标记放置于-60℃冰箱保存，用Western blot法检测AhR。

2　结　果

2.1各组大鼠血清中ALT、AST结果与正常组比，模型组大鼠的血清ALT、AST水平明显升高；与模型组比，药物预处理组能够降低血清中ALT、AST水平，EGb大剂量组与模型组比较有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　各组大鼠血清中ALT、AST结果

与正常组比，#P<0.01；与模型组比，*P<0.05

2.2肝脏病理学观察在光镜下，正常组中大鼠肝细胞结构完整，肝小叶和血管的形态及结构正常，肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，未见明显的充血、水肿，无变性和坏死，见图1(封二)；模型组大鼠肝组织排列没有规律，肝细胞有肿胀，局部坏死，见图2(封二)。EGb小剂量给药组淤血情况稍微减轻，其他没有很大改变，见图3(封二)。而在EGb大剂量给药组中央静脉和肝血窦淤血明显减轻，炎细胞浸润减少，见图4(封二)。

2.3Western blot检测大鼠肝组织AhR与正常组比，模型组大鼠肝组织中细胞核内的AhR的含量显著升高(P<0.01)。与模型组比，EGb大剂量组能明显降低AhR含量(P<0.05)，而EGb小剂量组降低AhR没有显著性差异。见图5。

图5　各组大鼠肝组织AhR与内参β-actin比值的变化。与正常组比，#P<0.01；与模型组比，*P<0.05

3　讨　论

3.1肠缺血再灌注导致的损伤在肠缺血再灌注时，会引起很多器官的损伤，在这些损伤中肝脏是肠缺血再灌注损伤中仅次于小肠本身最易受影响的器官[3]，夹闭肠系膜上动脉根部，直接造成肠系膜动脉狭窄而导致肝脏及其他脏器的首次缺血，再灌注后诱发的活性物质会导致肝脏的二次损伤。当小肠循环不稳定或者发生病理过程时，胃肠道的血液供应减少，再灌注时肝细胞就会受损，而主要存在线粒体和细胞膜的ALT、AST就会释放到血液中，通过检查血液中ALT、AST的含量就能反映缺血再灌注损伤的程度。本实验结果与上述理论一致，与对照组比，模型组显著升高；与模型组比，EGb大剂量组显著下降，实验结果表明EGb大剂量组给药对大鼠肠缺血再灌注引起的肝损伤有保护作用。

3.2银杏叶提取物银杏是传统的中药，含有多种化学成分，其已有悠久的药用历史。银杏叶提取物是从银杏叶中分离纯化的化合物，1965年被德国Willmar Schwabe将它首次用于临床，命名为银杏叶标准提取物EGb761，主要成分为总黄酮类和萜希内酯。其中黄酮是其主要成分之一，是一种天然的自由基清除剂，可以清除缺血损伤中产生的自由基。关于EGb大量的研究着重在治疗心脑血管疾病方面的应用，其相关的药理学基础研究也不断获得新的认识。研究表明[4，5]EGb761在心、脑、肺、肝、肾等脏器的缺血再灌注中起到保护作用，在另一方面，也有研究[6]证实银杏叶具有改善肝微循环，减轻其纤维化程度的作用。与上述研究一致，通过观察肝组织的病理切片发现：EGb能够减轻肝脏组织的损伤，而且大剂量给药效果更显著。

3.3AhR的生理功能AhR在肝、肺、小肠、肾脏、扁桃体、淋巴结等全身的组织器官中都存在[2]，是一种存在于细胞质的配体激活的转录因子。在正常生理状态下，AhR与多种蛋白形成复合物，以失活的状态存在于细胞胞浆中，当AhR受到外界应激刺激如感染、炎症和氧化反应后，AhR复合物立即转位到细胞核，再与转录因子等发生一系列的反应，当与配体结合活化，促进AhR表达可以明显抑制炎症反应。AhR在肠缺血再灌注肝损伤中的作用方面文献很少。本实验的数据显示AhR是一个上调机制，与前期Mehrabi 等[7]的研究数据一致，但却与Zhou等[8]研究大鼠脓毒败血症的研究结果不一致。其可能的原因是AhR本身是一个依赖胞浆浓度的核浆穿梭蛋白，而肠缺血再灌注损伤的机制本身就很特殊。本实验结果显示：与模型组比，给药组AhR含量有所下降，EGb大剂量组与模型组比较有显著性差异，进一步证明EGb对肠缺血再灌注导致的肝损伤有保护作用。

[1]刘花,高卉.银杏叶提取物对肝缺血再灌注NF-κB p65表达的影响[J].时珍国医国药,2015，26(12):2865

[2]景惠荣.MG-132减轻大鼠肠缺血再灌注肝损伤:伴有AhR和核因子κB信号通路的改变[D].大连：大连医科大学,2011

[3]千年松,帝振宇,陶开山.肝脏缺血再灌注损伤的发生机制研究进展[J].器官移植,2009,17(8):317

[4]Jurga B,Daiva M,Rimantas P,et al.The effect of Ginkgo biloba extract on mitochondrial oxidative phosphorylation in the normal and ischemic rat heart[J].Phytotherapy Research,2011,25(7):1054

[5]Tian XX,Wang BL,Cao YZ,et al.Comparison of protective effects of safflor injection and extract of ginkgo biloba on lung ischemia/Reperfusion injury in rabbits[J].Chin J Integr Med,2015,21(3):229

[6]黄强.银杏叶提取物对大鼠纤维化肝脏NF-κB活性的抑制作用[J].中国中医急症,2010,19(12):2102

[7]Mehrabi MR,Steiner GE,Dellinger C，et al.The arylhydrocarbon receptor (AhR),but not the AhR-nuclear translocator(ARNT),is increased in hearts of patients with cardiomyopathy[J].Virchows Arch,2002，441(5)：481

[8]Zhou M,Maitra SR,Wang P.The potential role of transcription factor aryl hydrocarbon receptor in downregulation of hepatic cytochrome P-450 during sepsis[J].Int J Mol Med，2008,21(4):423

Protective Effects of Ginkgo Biloba Extract on Intestinal Ischemia-reperfusion Injury in the Liver

ZENG Ting-ting,LIU Hua,GAO Hui

(HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Objective To investigate the protective effect of Ginkgo biloba extract on intestinal ischemia-reperfusion injury in the liver.Methods Healthy male SD rats were randomly divided into four groups:Normal group，model group，EGb low-dose group,and EGb high-dose group.The levels of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate transaminase(AST) were determined.The microscopical structure of the liver tissue was observed by HE staining.The expression of AhR was determined by Western blot.Results After intestinal ischemia and reperfusion，the serum ALT and AST significantly increased in rats and the expression of liver tissue of AhR increased significantly.Under the light microscope，the central vein and hepatic blood sinus congestion of liver tissue were serious and local tissue became necrosis.Compared with the model group，the levels of ALT and AST decreased significantly，AhR expression was significantly inhibited and congestion of liver tissue significantly reduced in EGb high dose group.Conclusion Ginkgo biloba extract has a protective effect on the liver injury of intestinal ischemia-reperfusion in rats，and its possible mechanism is by inhibiting the expression of AhR.

Liver injury;Ginkgo biloba extract;AhR

，E-mail:gaohuixn@163.com

R282.7

A

2095-4646(2016)04-0277-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.04.0277

2016-04-11)