老年住院患者肺炎克雷伯菌临床分离株多位点可变数目串联重复序列基因分型特征分析

张媛媛，徐雅萍，杜鹏程，强裕俊，张　雯，陈　晨，于季红，郭　军

1中国疾病预防控制中心传染病预防控制所　传染病预防控制国家重点实验室，北京 1022062首都医科大学附属北京地坛医院　传染病研究所，北京 1000153解放军总医院　南楼临床部检验科，北京 1008534清华大学医学中心　北京清华长庚医院呼吸内科，北京 1022185解放军总医院　南楼临床部呼吸内科，北京 100853



·论著·

老年住院患者肺炎克雷伯菌临床分离株多位点可变数目串联重复序列基因分型特征分析

张媛媛1，2，徐雅萍3，杜鹏程1，2，强裕俊1，张雯1，陈晨2，于季红3，郭军4，5

1中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室，北京 1022062首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所，北京 1000153解放军总医院南楼临床部检验科，北京 1008534清华大学医学中心北京清华长庚医院呼吸内科，北京 1022185解放军总医院南楼临床部呼吸内科，北京 100853

目的探讨老年住院患者肺炎克雷伯菌分离株多位点可变数目串联重复序列分析的基因分型特点。方法收集解放军总医院南楼临床部老年住院患者肺炎克雷伯菌临床分离菌株184株，提取基因组DNA，采用多重PCR和毛细管电泳对7个位点进行分析，利用BioNumerics 5.1软件进行聚类分析。结果184株肺炎克雷伯菌临床分离株共产生139种基因型，呈现明显的基因多态性；聚类分析结果显示，全部菌株可分为3个基因群，其中Ⅰ群包含93.06%的菌株。结论本医疗中心老年住院患者的肺炎克雷伯菌临床分离株具有明显的优势菌群，其感染来源仍以院内感染为主。

老年住院患者；感染；肺炎克雷伯菌；多位点可变数目串联重复序列分析

2Institute of Infectious Diseases，Beijing Ditan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100015，China

3Department of Clinical Laboratory in South Building，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

4Department of Respiratory Medicine，Beijing Tsinghua Changgung Hospital，

Medical Center，Tsinghua University，Beijing 102218，China

5Department of Geriatric Respiratory Medicine in South Building，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：434-437

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia，KP)是一种常见的革兰阴性人类机会性病原菌，在临床各种标本中检出率较高，常在免疫力低下宿主引起各种社区或医院获得性感染(包括肺炎、尿路感染、血流感染、脑膜炎和腹腔感染等)[1- 2]。对导致医院获得性感染的菌株进行分型，对指明可能的传播途径是不可缺少的技术手段。早期常应用脉冲场凝胶电泳对KP进行分型[3]，此技术的优点是不依赖于序列分析和分辨率高，缺点是费力且不能够对不同实验室间的结果进行比对。随后出现的是多位点序列分型技术[4]，它需要针对7个管家基因进行PCR和双向测序，使得对大批量菌株进行流行病学分析耗时且花费较高。KP分子流行病学研究亟需应用简便、快捷和花费相对低廉的新分型方法。KP和许多种类的细菌基因组一样，都包含可变数目串联重复序列(variable numbers of tandem repeats，VNTR)[5]。与多位点序列分型一样，VNTR分析和多位点VNTR分析(multiple locus VNTR analysis，MLVA)对细菌基因分型十分有用，可提供便携的结果用于实验室间相互比对和数据库登记。Turton等[6]于2010年首先报道将VNTR分析方案应用于KP分子分型。2014年，Brink等[7]应用MLVA技术进行KP院内传播的溯源分析，为KP的院内感染控制提供了一种简便、可靠的新型关键性技术。老年住院患者发生院内感染的机会较大，尤其是KP感染率高，耐药现象严重，不易治愈[8]，老年住院患者自然成为KP院内感染控制的重要目标监测人群。本研究利用MLVA技术，对分离老年住院患者的KP菌株进行分子分型，为科学有效控制KP的院内传播提供依据。

材料和方法

菌株来源与鉴定KP临床菌株分离自2008年1月至2014年1月，全部来自解放军总医院南楼临床部184例老年住院患者。由临床医生根据临床症状留取相应部位标本(痰液、尿液、血液等)并收集病例的背景资料，检验科进行细菌分离和培养，使用API系统(生物梅里埃公司，法国)对分离菌株进行菌种鉴定，被鉴定为肺炎克雷伯菌肺炎亚种(Klebsiellapneumoniaesubsp.pneumoniae，KPP)的菌株均纳入本研究。

多重PCR和毛细管电泳菌株经热灭活后，用DNA提取试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA，-20℃保存备用。多重PCR引物序列和荧光标记信息见表1。PCR反应体系采用20 μl体积，包括Taq酶反应预混液(含染料)(2×)(ThermoScience)10 μl，7对引物混合物(4 μmol/L)8 μl，DNA模板1 μl，以及去离子水1 μl。反应条件为，预变性95℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 60 s，30个循环，延伸68℃ 30 min[5]。获得PCR产物采用ABI 3730基因分析仪进行毛细管电泳，电泳结果用Gene-Mapper软件进行分析，根据PCR产物大小计算该位点的重复次数。

聚类分析使用BioNumerics(Version 5.1)软件进行聚类分析，聚类方法为平均连锁聚类法，基因型完全一致的菌株定义为一簇，与本研究内任何菌株基因型均不一致的基因型定义为单一基因型。计算各位点等位基因多样性(h)以及7个检测位点的Hunter-Gaston分辨率指数[9]。采用Hawkey等[10]对等位基因多态性的分级标准确定各位点的多态性分辨能力级别。

结　　果

菌株一般情况共纳入184株KPP，菌株分离自2008至2014年共184例住院患者，当1例病例分离多株KPP时，仅纳入首次分离的菌株。184株KPP中，125株(67.9%)分离自呼吸道标本(痰液)，41株(22.3%)分离自泌尿系统(尿液或尿道分泌物)，其余分离自血液、胆汁、胃液和腹腔引流液。184例住院患者中，80～89岁患者114例(62%)，患者数最多，全部患者均大于60岁。

等位基因多态性通过计算各位点等位基因多样性(h)，可见各位点的等位基因多态性即h具有较大差异。等位基因多态性最高的位点是27#位点(h=0.8751)。根据等位基因多态性的分级标准，本研究涉及的位点中4个(27#、45#、52#和60#)为高分辨能力位点(h>0.6)，3个为中等分辨能力位点(0.3≤h≤0.6)(表1)。7个位点的Hunter-Gaston分辨率指数为0.9942。

MLVA分型经MLVA分型分析，184株KPP共产生139个MLVA型别，呈明显的多态性。以100%相似值水平进行分析，70株(38.04%)KPP为单一基因型，114株(61.96%)分属于25个型别，各型别包含2～10株KPP，包含菌株最多的1个型别(3- 4- 4- 1- 2- 1- 6)有10株，占所有菌株的5.43%。将差异位点数≤2的菌株进行聚类，结果显示184株KPP中的173株可分为3个基因群(Ⅰ～Ⅲ群)，其中包含菌株数量最多的基因群为Ⅰ群，共161株(93.06%)，Ⅱ群包含10株(5.78%)，Ⅲ群包含2株(1.15%)(图1)。

讨　　论

在我国，目前克雷伯菌属是仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌，其导致的医院获得性感染发病率较高，其中又以KPP最为常见。老年住院患者常因自身免疫功能下降，长期使用抗生素，接受有创性操作和住院时间较长等因素，成为KPP感染的目标人群[8]。利用MLVA分型技术对老年住院患者临床样本中分离的KPP进行分子流行病学研究，可以帮助认识KPP的传播过程与特点，为更好地控制KPP的院内传播提供新型监测方法。MLVA分型方法具有操作简单、结果数字化、易于分析、分辨率高和可重复性强等优点，为确定菌株间的亲缘关系提供了可靠的技术手段，可用于探索菌株间的相关性、追溯传染源、传播过程等，尤其适用于短期内暴发流行的调查[5]。近年来，随着分子生物学技术的发展，以多重PCR和毛细管电泳片段扫描为基础的MLVA实验流程，为这种方法的推广应用以及标准化提供更好的解决方案[7]。

对本研究中涉及的7个位点的多态性指数(h值)进行计算，6个位点的多态性与国外报道[7]近似，51#位点的多态性(h=0.3466)明显偏低，这可能是因为

表 1　多位点可变数目串联重复序列分析分型方法的VNTR位点信息和引物序列Table 1　VNTR information and primer sequence for the multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis scheme

VNTR：可变数目串联重复序列；FAM：羧基荧光素；VIC：绿色荧光蛋白

VNTR： variable numbers of tandem repeats；FAM：carboxyfluorescein；VIC： green fluorescent protein

图 1173株肺炎克雷伯菌最小生成树

Fig 1Minimum spanning tree of 173klebsiellapneumoniastrains by multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis

本院具有的主要流行菌株本身的同源性比较高，与国外研究中选取的菌株分属不同的进化分枝有所不同。这一结果提示，应根据我国主要流行菌株的基因组信息进行深入分析和扩大菌株样本量的实验验证结果，选取合适的位点形成我国的KPP菌株基因分型技术方案。通过MLVA分型，KPP菌株可分为3个基因群，其中161株菌株聚集在Ⅰ群，表明该医疗中心老年住院患者KPP感染的主要优势菌群比较单一，这一结果也强烈提示院内感染是KPP感染的主要来源。在以后的研究中，将对同一地区内的其他医院同期分离KPP进行MLVA分型，以确证这一结论。虽然不排除少量的输入性感染(Ⅱ、Ⅲ群)，但需要明确的是，在住院过程中严格控制院内感染的发生，对于避免KPP传播、减少感染人数有着积极的作用。

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Genotyping of Klebsiella Pneumonia Strains Isolated from Eldly Inpatients by Multiple-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis

ZHANG Yuan-yuan1，2，XU Ya-ping3，DU Peng-cheng1，2，QIANG Yu-jun1，ZHANG Wen1，CHEN Chen2，YU Ji-hong3，GUO Jun4，5

1State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，National Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

GUO JunTel：010- 66876432，E-mail： dragonet76@163.com

ObjectiveTo investigate the genotype ofklebsiellapneumoniastrains isolated from eldly inpatients by multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis. MethodsTotally 184klebsiellapneumoniastrains，isolated from eldly inpatients，were collected，and their genome DNA were extracted. The polymorphism of 7 variable-number tandem-repeat locus in the DNA samples was analyzed by multiple primers polymerase chain reaction and capillary electrophoresis. The clustering analysis of genotyping was carried out with the BioNumerics 5.1 software. ResultsA total of 139 genotypes were identified in 184klebsiellapneumoniaclinical strains，showing obvious genetic polymorphisms. With clustering analysis of genotypes，all the strains were categorized into three gene clusters (genogroups Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲ). The genogroup Ⅰ was the biggest cluster，containing 93.06% of the isolated strains. ConclusionThere was a predominant cluster in theklebsiellapneumoniastrains isolated from eldly inpatients in our center，and the major source ofklebsiellapneumoniainfection remained the nosocomial infection.

eldly inpatients；infection；klebsiellapneumonia；multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis

中国博士后科学基金面上资助(2014M562610) Supported by China Postdoctoral Science Foundation (2014M562610) ;张媛媛和徐雅萍对本文贡献相同 ZHANG Yuan-yuan and XU Ya-ping contributed equally to this article

郭军电话：010- 66876432，电子邮件： dragonet76@163.com

R183.3

A

1000- 503X(2016)04- 0434- 04

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.012

2015- 09- 07)