鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取工艺研究

黄爱妮，汪海波，李丽，胡小泓，周胜男（.武昌工学院食品工程学院，湖北武汉 430065；.武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北武汉43003）

鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取工艺研究

黄爱妮1，汪海波2，李丽1，胡小泓1，周胜男1
（1.武昌工学院食品工程学院，湖北武汉 430065；2.武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北武汉430023）

以鲢鱼鱼皮为原料，通过单因素试验和正交试验对鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白的提取工艺参数进行分析，并用AR-500动态流变仪对鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白的热变性温度进行分析。结果表明：鲢鱼鱼皮原料中酸溶性胶原蛋白提取的最佳工艺条件为：以乙酸作为提取剂，乙酸浓度0.3 mol/L，料液比1∶60（g/mL），提取时间96 h；此胶原蛋白的热变性起始温度为32.31℃，峰值温度为34.82℃。

鲢鱼皮；酸溶性胶原蛋白；提取

胶原又称胶原蛋白，是动物体内含量多、分布广的蛋白质，约占体内蛋白质总量的25%～30%。胶原蛋白在传统上主要是从陆生动物如猪、牛等的皮、骨中提取，但由于牲畜疾病的爆发，以及宗教信仰等原因，猪、牛等来源的胶原蛋白制品的提取和使用受到了限制［1-2］。哺乳动物皮肤胶原的酸溶解性较低，而鱼皮中胶原蛋白的酸溶解性相对较高，因此，作为猪、牛等的替代原料，从鱼类加工废弃物鱼皮、鱼鳞和鱼骨等中提取酸溶性胶原蛋白，越来越受到人们的重视［3-5］。

我国是世界上最大的淡水鱼养殖国，而湖北作为全国淡水鱼生产第一大省，2014年湖北省全年水产品总量433.3万t，连续19年居全国第一，水产业已成为湖北省农业的一个重要支柱。湖北主要养殖淡水鱼品种包括青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼等。随着鱼类加工业的快速发展，加工过程中产生大量的废弃物，包括鱼皮、鱼鳞和鱼骨等，约占鱼体总重的40%～55%［6］。据报道，鱼皮中胶原蛋白含量最高可达80%以上［7-9］，因此从鱼皮中提取胶原蛋白不仅能够充分利用资源，提高鱼类加工的附加值，而且可以减少环境污染，对促进鱼类加工业的发展具有重要意义。

目前，国内外对鲢鱼加工下脚料的研究主要集中在鱼鳞的深加工，对鱼皮的研究较少［10-12］。因此，本研究以鲢鱼鱼皮为原料，在低于胶原蛋白变性温度的条件下进行酸溶性胶原蛋白的提取，研究原料鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取的最佳工艺条件，并对其热变性温度进行测定，以期为鲢鱼鱼皮的加工利用提供一些理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

鲢鱼皮：武汉市白沙洲菜场提供；L-羟脯氨酸标准品：Sigma公司；无水Na2CO3、氯胺T、对二甲氨基苯甲醛、NaOH、无水乙醚、乙酸、正丁醇、氯化钠、盐酸、柠檬酸等：均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

SE602F型电子分析天平：奥豪斯仪器有限公司；T6型紫外分光光度计：北京普析仪器有限公司；HHS22型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；LD5-2B型台式低速离心机：北京京立离心机有限公司；FE20型酸度计：梅特普-托利多仪器有限公司；AR-500动态流变仪：美国TA公司。

1.3方法

1.3.1鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白的制备工艺路线

1.3.1.1工艺流程

鱼皮→脱杂蛋白→沥干后用水充分洗涤沥干→脱脂→沥干后用水充分洗涤沥干→加酸溶解→过滤分离滤液和残渣→滤液盐析→离心分离→乙酸复溶→透析→冻干→酸溶性胶原蛋白

1.3.1.2操作要点

鱼皮洗净表面杂质和黑色素，沥干后剪碎，以0.6 mol/L的Na2CO3溶液为杂蛋白脱除试剂，在25℃下处理2次，每次6 h进行脱杂蛋白处理；采用无水乙醚作为脱脂试剂，在料液比为1∶80（g/mL）下处理16 h进行脱脂处理。脱杂后的鱼皮用酸溶液溶解，在一定的温度下浸提，浸提结束后过滤，弃去滤渣，将收集起来的滤液加入氯化钠盐析，使氯化钠终浓度达2.6 mol/L，盐析时间为14 h。盐析后的溶液以5 000 r/min的速度离心20 min，弃去上清液，沉淀以0.5 mol/L醋酸溶解后，转入透析袋以高纯水透析，至无氯离子检出。倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后，得到酸溶性胶原蛋白产品。

1.3.2鱼皮原料及提取液中羟脯氨酸含量的测定方法

胶原蛋白中的羟脯氨酸在其他蛋白中很少见，可视为胶原蛋白所特有的，因此，通过测定胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，可以间接评价胶原蛋白的提取效果。

1.3.2.1羟脯氨酸的测定方法

L-羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558 nm处测定吸光度并与标准比较，可定量羟脯氨酸的含量。

取4.0 mL L-羟脯氨酸标准液于25 mL比色管中，加入2.0 mL氯胺T溶液，混匀后于室温下放置20 min。取4.0 mL水于25 mL比色管中，与标准液同步试验，可得空白。加入2.0 mL对二甲氨基苯甲醛与高氯酸按比例配制而成的显色剂，充分混匀后，迅速将比色管放入60℃水浴中加热20 min后取出比色管，用冰水冷却比色管3 min，然后在室温下放置30 min。用空白管作参比，在波长558 nm处以紫外分光光度计测定其吸光度值。以标准液的吸光度值为纵坐标，相对应的量为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2.2鱼皮中羟脯氨酸提取率的计算

取1 g鱼皮剪碎，放入100 mL具塞比色管中，加入30 mL 3 mol/L的硫酸溶液，并盖上塞子，置于恒温干燥箱中，105℃水解6 h。趁热将水解产物用滤纸过滤至250 mL容量瓶中，用10 mL硫酸溶液分3次洗涤比色管或三角烧瓶和滤纸，滤干后，用10 mL水洗涤滤纸，合并上述溶液。用移液管移取10 mL该水解液至100 mL容量瓶中，加水50 mL，用氢氧化钠溶液将pH调至中性再用水定容至刻度，所得溶液为待测液。取4.0 mL处理好的待测液于25 mL比色管中，按照1.3.2.1的方法测定鱼皮原料中的羟脯氨酸含量。

鱼皮原料进行胶原蛋白提取后，按照上述方法测定提取液中的羟脯氨酸含量，按照式1计算羟脯氨酸提取率。

羟脯氨酸提取率/%=

1.3.3鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白的提取工艺研究的单因素试验

1.3.3.1提取剂种类对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响

取预处理后的鲢鱼皮3份，经脱杂蛋白处理和脱脂处理后，分别加入0.5 mol/L的盐酸、乙酸、柠檬酸80 mL，在一定的温度下浸提72 h。浸提结束后过滤，测定滤液中羟脯氨酸的含量，计算胶原蛋白的提取率。

1.3.3.2提取剂浓度对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响

取预处理后的鲢鱼皮4份，经脱杂蛋白处理和脱脂处理后，以乙酸为提取剂，分别调节乙酸浓度为0.3、0.5、0.7、0.9mol/L，料液比1∶80（g/mL），在4℃下浸提24h。浸提结束后过滤，测定滤液中羟脯氨酸的含量，计算胶原蛋白的提取率。

1.3.3.3提取时间对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响

取预处理后的鲢鱼皮4份，经脱杂蛋白处理和脱脂处理后，以0.5 mol/L乙酸为提取剂，料液比为1∶80 （g/mL），在4℃下分别浸提24、48、72、96 h。浸提结束后过滤，测定滤液中羟脯氨酸的含量，计算胶原蛋白的提取率。

1.3.3.4料液比对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响

取预处理后的鲢鱼皮4份，经脱杂蛋白处理和脱脂处理后，以0.5 mol/L乙酸为提取剂，调节料液比分别为1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL），在4℃下浸提72 h。浸提结束后过滤，测定滤液中羟脯氨酸的含量，计算胶原蛋白的提取率。

1.3.4鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白的提取工艺研究的正交试验

在单因素试验的基础上，以提取剂浓度、提取时间、料液比为考察因素，以鱼皮中酸溶性胶原蛋白的提取率为指标，选择L9（34）正交表进行正交试验，试验因素水平表见表1。

表1　正交试验因素水平表Table 1　Orthogonal factor level table

1.3.5鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白的热变性温度测定

用去离子水配制0.6%浓度的酸溶性胶原蛋白水溶液，用AR-500动态流变仪分析温度对胶原蛋白影响的趋势，测定胶原蛋白的热变性温度。

2　结果与分析

2.1鱼皮原料及提取液中羟脯氨酸含量测定的标准曲线

通过比色法，用空白作参照，在波长为558 nm处以紫外分光光度计测定出胶原蛋白中特有的羟脯氨酸含量的方法，来间接评价胶原蛋白的提取效果。用1.3.2的方法，绘制出羟脯氨酸含量的标准曲线如图1所示。

图1　羟脯氨酸含量的标准曲线Fig.1　The standard curve of hydroxyproline content

测定标准曲线为y=0.146x+0.013，式中：x为羟脯氨酸质量浓度（μg/mL）；y为558 nm处吸光度。R2= 0.987。

2.2鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取工艺优化的单因素试验结果

2.2.1提取剂种类对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响

提取剂种类对胶原蛋白提取率的影响试验结果如图2所示。

图2　提取剂种类对胶原蛋白提取率的影响Fig.2　Effect of extracting agent types on collagen extraction rate

从图2可以看出，在其他条件相同的情况下，乙酸对鱼皮胶原蛋白的提取最高，提取率可达61.65%；盐酸次之，提取率为44.06%；柠檬酸的提取率最低，为19.45%。因此，选择乙酸作为鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取的最佳提取剂。

2.2.2提取剂浓度对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响

提取剂浓度对胶原蛋白提取率的影响试验结果如图3所示。

图3　提取剂浓度对胶原蛋白提取率的影响Fig.3　Effect of extracting agent concentration on collagen extraction rate

从图3中可看出，当乙酸浓度在0.5 mol/L以下时，鱼皮中酸溶性胶原蛋白的提取率随着乙酸浓度的增大而增大，当乙酸浓度为0.5 mol/L时，鱼皮中酸溶性胶原蛋白的提取率最高。当乙酸浓度继续增大时，胶原蛋白的提取率反而下降，因此，选择乙酸浓度为0.5 mol/L。

2.2.3提取时间对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响

提取时间对胶原蛋白提取率的影响试验结果如图4所示。

图4　提取时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.4　Effect of extracting time on collagen extraction rate

由图4可知，随着提取时间的增加，鱼皮中胶原蛋白的提取率逐渐增大，说明鱼皮中的胶原蛋白需要一定的时间才能被提取剂浸提出来。但当浸提时间超过72 h后，胶原蛋白提取率的增加变缓，可能是由于提取剂的提取能力已经达到饱和，考虑到节约提取成本，因此，选择最佳提取时间为72 h。

2.2.4料液比对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响

料液比对胶原蛋白提取率的影响试验结果如图5所示。

图5　料液比对鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响Fig.5　Effect of solid-liquid ratio on collagen extraction rate

从图5可知，料液比分别为1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）时，鱼皮中酸溶性胶原蛋白的提取率分别为58.07%、61.65%、62.05%、62.68%，即料液比为1∶60（g/mL）时鱼皮胶原蛋白的提取率最高。可能是由于提取剂用量较少时，鱼皮原料与提取剂未能充分接触，影响了提取效果，当料液比逐渐降低，即提取剂用量逐渐增大时，胶原蛋白的提取率也随之增大，但当料液比从1∶60（g/mL）降低到1∶70（g/mL）后，提取率的增加变缓，考虑到节约试剂，因此，选择最佳料液比为1∶60（g/mL）。

2.3酸溶性鱼皮胶原蛋白提取工艺优化的正交试验结果

在单因素试验的基础上，以乙酸浓度、提取时间、料液比为考察因素，以鱼皮中酸溶性胶原蛋白的提取率为指标，选择L9（34）正交表进行正交试验，正交试验结果表见表2，方差分析表见表3。

由表2和表3可知，各因素对鲢鱼皮中酸溶性胶原蛋白提取率的影响重要程度依次是乙酸浓度＞提取时间＞料液比，其中乙酸浓度、提取时间对胶原蛋白的提取率都有非常显著的影响，料液比对胶原蛋白提取率的影响很小。最优方案为A2B3C1，即料液比1∶60 （g/mL），提取时间96 h，乙酸浓度0.3 mol/L。

表2　正交试验结果表Table 2　Results of orthogonal experiment

表3方差分析表Table 3　Analysis on variance about orthogonal experiment

取预处理后的鲢鱼皮，加入0.3 mol/L乙酸溶液进行提取，调节料液比为1∶60（g/mL），浸提96 h，在此条件下对鲢鱼皮中的酸溶性胶原蛋白进行提取，提取率为76.23%，高于正交试验中所有工艺参数组合下的提取率，证明了正交试验的正确性。

2.4鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白的热变性温度

用去离子水配制0.6%浓度的酸溶性胶原蛋白水溶液，用AR-500动态流变仪分析温度对胶原蛋白影响的趋势，测定得到鲢鱼鱼皮中酸溶性胶原蛋白的热变性起始温度为32.31℃，峰值温度为34.82℃，因此，在提取过程中应该将温度控制在32.31℃以下。

3　结论

鲢鱼鱼皮原料中酸溶性胶原蛋白提取的最佳工艺条件为：以乙酸作为提取剂，乙酸浓度0.3 mol/L，料液比1∶60（g/mL），提取时间96 h；此胶原蛋白的热变性起始温度为32.31℃，峰值温度为34.82℃。

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Study on Extraction of Acid-Soluble Collagens from Silver Carp Skin

HUANG Ai-ni1，WANG Hai-bo2，LI Li1，HU Xiao-hong1，ZHOU Sheng-nan1
（1.College of Food Engineering，Wuchang Institute of Technology，Wuhan 430065，Hubei，China；2.College of Chemical and Environmental Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

With silver carp fish skin as raw material，the optimal extraction parameters of acid-soluble collagens were explored by single factor test and orthogonal test.The denaturation temperatures of acid-soluble collagens were analyzed by AR-500 dynamic rheometer.The results showed that the optimal parameters for the extraction of acid-soluble collagens from silver carp skin were with acetate as the extraction agent，the concentration of acetic acid 0.3 mol/L，material/liquid ratio of 1∶60（g/mL）for 96 h.The starting denaturation temperature of acid-soluble collagens from silver carp skin was 32.31℃，and the peak temperature was 34.82℃.

silver carp skin；acid-soluble collagens；extraction

2015-10-13

湖北省教育厅科学研究计划项目（B2014127）

黄爱妮（1985—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品新资源开发与利用。