嗜酸乳杆菌细菌素对鲜乳保质期的影响及防腐技术体系的建立

王　莹，赵瑞香，马艳艳，梁新红（河南科技学院 食品学院，河南 新乡 453003）

嗜酸乳杆菌细菌素对鲜乳保质期的影响及防腐技术体系的建立

王莹，赵瑞香*，马艳艳，梁新红
（河南科技学院 食品学院，河南 新乡 453003）

研究嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）产细菌素lactobacillin XH1对鲜乳保质期的影响。将0.5 g/kg嗜酸乳杆菌细菌素lactobacillin XH1分别添加到鲜乳和消毒鲜乳中，分析其在4℃贮藏期间抑菌活性、酸度、感官特性的变化趋势。通过在消毒鲜乳中添加嗜酸乳杆菌细菌素lactobacillin XH1，建立消毒鲜乳防腐应用中的危害分析和关键环节控制点（HACCP）技术体系。结果表明，4℃条件下贮藏，添加细菌素lactobacillin XH1的乳样的抑菌活性显著大于未添加细菌素lactobacillin XH1的乳样，且酸度变化趋势平缓，仍保持产品原有的风味、色泽、质构等感官特性，有效地延长鲜乳保质期2 d，消毒鲜乳保质期4～6 d。并建立了嗜酸乳杆菌细菌素lactobacillinXH1在消毒鲜乳防腐应用中的HACCP体系，确保产品的安全性。

嗜酸乳杆菌；细菌素；鲜乳；保质期；危害分析与关键控制点

牛乳营养丰富全面，是最理想的天然食品，西方人称牛乳是人类的保姆，它所具有的原生营养性是其他任何人造营养品都无法比拟的［1-3］。除膳食纤维外，牛乳含有人体所需要的全部营养物质［4-5］。正是由于牛乳有着丰富而完全的营养成分，所以它是各种微生物的天然培养基［6］，极易被微生物所污染，从而使牛乳及乳制品的保质期大为缩短，影响乳及其产品的质量。因此，寻找一种天然而经济的乳品防腐剂并建立相应的防腐技术体系，一直是乳品工业和研究人员所关心的问题［7］。

危害分析与关键点控制（hazard analysiscriticalcontrol point，HACCP）体系是通过实践验证最具科学性的能够确保食品安全与卫生的预防性控制体系，其在乳及乳制品中的应用是对于其在生产过程中实施全过程的危害分析和关键点控制，并确定预防措施，以期消除或降低在生产的各个环节可能造成的危害，从而提高食品的安全性，达到控制以及监管的目的，降低食源性疾病的发生，为食品生产提供了更为安全的产品质量控制方法［8-11］。由于HACCP体系是目前保证食品安全性最有效和最经济的方法，所以其在食品生产中的广泛应用必将是未来发展的趋势［12-13］。

人们对化学防腐剂的安全性越来越担忧，利用食品级微生物嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）产生的细菌素［14-16］作为生物型防腐剂，阻止乳中腐败菌和致病菌的生长繁殖，从而克服化学防腐剂的安全隐患，对于提高乳和乳制品的安全与品质，有着重要的现实意义。食品安全国家标准GB/T 2760—2014《食品添加剂使用标准》中规定乳酸链球菌在乳及乳制品中的最大添加量为0.5 g/kg［17-18］。鉴于此，本试验将嗜酸乳杆菌发酵上清液经70%饱和度硫酸铵沉淀透析，HiTrap Capto Q离子柱进一步纯化，冷冻干燥后所得细菌素lactobacillin XH1，按照0.5 g/kg添加到鲜乳和消毒鲜乳中，在4℃下贮藏，考察和评价细菌素lactobacillin XH1对于延长鲜乳及消毒鲜乳保质期的影响，建立嗜酸乳杆菌细菌素lactobacillin XH1在消毒鲜乳防腐应用中的HACCP技术体系，以期为嗜酸乳杆菌细菌素在乳及乳制品防腐应用中提供理论参考和技术支撑。

1　材料与方法

1.1料与试剂

嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）（简写为La-XH1）：由河南科技学院食品研究所保藏提供；鲜牛乳：新乡市康元乳业有限公司。

MRS液体培养基［19］：蛋白胨1%，葡萄糖2%，乙酸钠0.5%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1%，柠檬酸氢二铵0.2%，MgSO4·7H2O 0.058%，MnSO4·4H2O 0.025%，K2HPO40.2%，吐温80 0.1%，调pH 6.2～6.4，121℃灭菌15m in。

蛋白胨、琼脂粉、牛肉膏、硫酸镁、硫酸锰、酵母浸粉、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钾、柠檬酸二铵、无水乙酸钠、氯化钠、琼脂等均为国产生化试剂和分析纯。

1.2器与设备

SW-CJ-1D单人单面垂直净化工作台：苏州智华净化精密仪器有限公司；SHP-250型生化培养箱：上海三发科学仪器有限公司；YXQ-LS-50G型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅仪器有限公司；101-3型恒温干燥箱：上海浦鸿仪器厂；JA2003型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；H2050R台式高速冷冻离心机湘仪：湖南湘仪实验仪器开发公司；85-1B型磁力搅拌器：上海鹰迪仪器设备有限公司；FT74XTS UHT/HTST系统：湖北恒绿工程技术有限公司。

1.3验方法

1.3.1菌素lactobacillin XH1的制备［20］

将活化后的嗜酸乳杆菌La-XH1按2.5%的接种量加入到pH 6.5的MRS液体培养基中，37℃培养18h，经10000 r/min、4℃、15min离心去沉淀，经0.22μm孔径无菌滤膜过滤后，放入4℃冰箱保存备用。发酵上清液中加入70%饱和度的硫酸铵，采用磁力搅拌器缓慢搅拌直至溶解，4℃下过夜，10 000 r/m in、4℃、10min离心收集沉淀蛋白，50mmol/L、pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，截留分子质量为1 ku的透析膜在相同磷酸盐缓冲液中透析24 h，在透析过程中多次更换缓冲液；再经HiTrap Capto Q离子柱进一步纯化，收集目标峰后冷冻干燥。

1.3.2菌素lactobacillin XH1对鲜乳保质期的影响

在鲜乳中加入0.5 g/kg（按照食品安全国家标准防腐剂最大使用量）细菌素，并以无菌生理盐水作对照，采用实验室小型台式真空包装机进行无菌真空包装，在4℃条件下贮藏，隔天测试培养基内的细菌菌落总数［21］，同时对牛乳进行酸度的测定［22］、煮沸实验，并对乳的感官指标进行评价。

1.3.3菌素lactobacillin XH1对消毒鲜乳货架期的影响

将提取的细菌素按照食品安全国家标准防腐剂最大使用量0.5 g/kg加入到消毒鲜乳中，在80～85℃条件下灭菌10～15 s，冷却后无菌装入塑料袋中，密封，在4℃下贮藏，加入等体积生理盐水的消毒鲜乳作为空白对照。隔天测其细菌菌落总数，并对消毒鲜乳进行酸度的测定、煮沸实验以及对乳的感官指标评价。

1.3.4官指标测试

将各种试验处理下的乳样，按时间段采样，分别对其气味、色泽、组织状态、口感进行评定，满分100分。评议小组由10位食品感官评定专家组成，评定标准见表1［23-25］。

表1　鲜乳感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standard of fresh m ilk

1.3.5菌素lactobacillin XH1应用于消毒鲜乳中HACCP体系的建立

依据HACCP体系的7个原理和12项基本步骤［26］，将细菌素lactobacillin XH1应用于消毒鲜乳中，并对各工艺步骤可能会发生的生物性、物理性、化学性危害做出分析，确定控制措施、关键控制点和关键控制限值，建立纠偏措施、审核程序和记录文件管理程序，逐步建立针对细菌素lactobacillin XH1应用于消毒鲜乳的HACCP计划。

1.3.6据统计与分析

所有试验数据均重复3次，采用Origin 7.0和Excel2003对各试验数据进行统计学分析。

图1　鲜乳在4℃下贮藏期间细菌菌落总数（a）和酸度（b）的变化Fig．1 Changes o f totalbacterial count（a）and acidity（b）of fresh m ilk at 4℃

2　结果与分析

2.1菌素lactobacillin XH1对鲜乳保质期的影响

将0.5 g/kg细菌素lactobacillin XH1添加到鲜乳中，无菌真空包装，4℃条件下冷藏，隔天取乳样测定其细菌菌落总数、酸度变化情况，结果见图1，并对鲜乳进行煮沸试验和感官评价，结果见图2。

图2　鲜乳在4℃下贮藏期间的感官评价Fig．2 Sensory evaluation of fresh m ilk during storage at4℃

由图1、图2可知，鲜乳在4℃下贮藏5 d内，不加细菌素的乳样在第2天细菌数为3.0×106CFU/m L，酸度值为20°T，指标均超出鲜乳食品安全国家标准GB/T 19301—2010《生乳》中要求细菌菌落总数≤2×106CFU/g（m L）、酸度12～18°T的上限，并且经煮沸后乳样开始出现凝固，第3天时乳样出现大量絮片，色泽青色，有酸臭味产生。添加细菌素的乳样各个指标均比对照变化缓慢，在贮藏的第4天，细菌菌落总数刚达到4.5×106CFU/m L，酸度20°T，开始出现腐败变质现象。不加细菌素的鲜乳保质期为2 d，添加细菌素的鲜乳保质期为4 d，从而有效地延长鲜乳保质期2 d。因此细菌素lactobacillin XH1能够有效抑制乳中杂菌的生长繁殖，控制鲜乳的酸败，从而有效延长鲜乳保质期。

2.2菌素lactobacillin XH1对消毒鲜乳保质期的影响

将0.5 g/kg细菌素lactobacillin XH1添加到消毒鲜乳中，采用125～130℃下灭菌2～4 s的高温短时（high temperature short time，HTST）杀菌，冷却后真空无菌装入塑料袋中密封，再4℃条件下冷藏，之后隔天测定乳样的细菌数和酸度变化情况，结果见图3，并对消毒鲜乳进行煮沸试验和感官评价，结果见图4。

由图3、图4可知，消毒鲜乳在贮藏期间，不加细菌素的乳样在第34天细菌菌落总数达到1.2×105CFU/m L，酸度值为20°T，指标已超出消毒乳食品安全国家标准GB/T 19645—2010《巴氏杀菌乳》中要求细菌总数5×104～105CFU/g（m L）、酸度12～18°T的上限，在第36天时，明显有酸味和稠状物产生，煮沸后沉淀，色泽暗淡，发生严重腐败变质现象；然而添加细菌素后的乳样随着贮藏时间的延长，细菌数比对照少2～3个数量级，在第40天细菌数的数量级才达到105，酸度值为25°T。由此得出不加细菌素的消毒乳的保质期为34～36d，添加细菌素的消毒乳的保质期为40 d。说明细菌素lactobacillin XH1对食品腐败菌和致病菌有较好的抑制作用，因此，在消毒鲜乳中添加细菌素lactobacillin XH1，能够有效的延缓生化反应速率，从而延长消毒鲜乳保质期4～6 d，提高产品的安全性。

图3　消毒鲜乳在4℃下贮藏期间细菌菌落总数（a）和酸度（b）的变化Fig．3 Changes o f totalbacterial count（a）and acidity（b）of ste rilized fresh m ilk du ring storage at 4℃

图4　消毒鲜乳在4℃下贮藏期间的感官评价Fig．4 Sensory evaluation o f sterilized freshm ilk during storage at4℃

2.3菌素lactobacillin XH1应用于消毒鲜乳中HACCP体系的建立

2.3.1菌素lactobacillin XH1应用型消毒鲜乳产品描述

配方：新鲜牛乳，纯化后的嗜酸乳杆菌细菌素lactobacillin XH1。

感官特性：色泽呈均匀一致的乳白色或微黄色；具有消毒乳固有的纯香味；组织细腻、均匀。

理化指标：脂肪≥3.1 g/100 g，蛋白质≥2.9 g/100 g，酸度16～18°T。

卫生指标：防腐剂，黄曲霉毒素，大肠杆菌数，金黄色葡萄球菌等致病菌均符合国家标准［17，24，27］。

2.3.2毒鲜乳制作工艺流程

2.3.3毒鲜乳生产过程危害分析与关键控制点（CCP）的确定

乳与乳制品在储存、运输、生产加工到产品销售各个环节中均可能受到生物性、化学性、物理性的危害，从而引起污染而造成腐败变质，使乳及乳制品丧失食用价值，并造成食源性疾病的发生。通过对消毒鲜乳生产加工步骤进行详细的危害分析，并结合决策树原则，确定了该消毒鲜乳生产过程中5个关键控制点（critical control point，CCP），即原料乳的验收与处理、设备管道就地清洗（clean-in p lace，CIP）、标准化、HTST杀菌、无菌灌装。通过对生产过程中的关键控制点CCP的控制，最大程度地减少或降低危害，以保持鲜乳的品质，提高鲜乳的安全性。

2.3.4HACCP计划制定

对危害分析表中识别出的危害进行评估，将有可能发生和一旦失控可能给消费者带来不可接受的健康风险的点确定为显著危害，并提出有效的控制措施和纠偏措施。关键控制点是最能有效控制显著危害的点［28］，根据5个关键控制点确定各控制点的关键限值、监控程序和纠偏措施，制作嗜酸乳杆菌细菌素Lactobacillin XH1应用于消毒鲜乳的HACCP计划，结果见表2。

表2 HACCP计划Table 2 HACCP plan

3　结论

食品级微生物嗜酸乳杆菌的代谢产物细菌素具有无毒、无害、无残留、无抗药性等优点，是目前最有应用前景的天然食品防腐剂之一，若将其应用于乳及乳制品中，不仅能够克服化学防腐剂的安全隐患，也能够持久保持防腐效果。研究表明，将本实验室保藏的嗜酸乳杆菌La-XH1所产生的细菌素lactobacillin XH1按0.5 g/kg添加到鲜乳和消毒鲜乳中，验证和评价了细菌素在延长鲜乳保质期中的明显效果。由试验结果得出，在4℃下，添加细菌素lactobacillin XH1能够有效延长鲜乳保质期2d，消毒鲜乳保质期4～6d，说明嗜酸乳杆菌细菌素lactobacillin XH1可以有效控制乳品中微生物的生长，从而延缓鲜乳的腐败变质。通过观察鲜乳中添加细菌素lactobacillin XH1的变化，根据对消毒鲜乳生产过程各个环节可能造成的潜在危害进行物理、化学和生物分析，确定关键控制点、关键限值、监控程序、纠偏措施、验证程序和记录保持程序，逐步建立起嗜酸乳杆菌细菌素lactobacillin XH1应用于消毒鲜乳中HACCP防腐技术体系，以期为嗜酸乳杆菌细菌素在乳及乳制品防腐应用提供理论参考和技术支撑。

［1］田树清.胎次和泌乳阶段对奶牛外周血白细胞和乳体细胞及相关酶活性影响的研究［D］.扬州：扬州大学硕士论文，2010.

［2］张雪梅.浅谈牛奶的营养价值与健康的密切关系［J］.科技与创新，2014，2（23）：106-107.

［3］杨永新，王加启，卜登攀，等.牛乳重要营养品质特征的研究进展［J］.食品科学，2013，34（1）：328-332.

［4］鹿玉菲，高新平.牛奶的营养与人体健康［J］.大家健康（学术版），2013，7（3）：161-162.

［5］张鹏飞.论牛奶营养与健康［J］.内蒙古教育：职教版，2012（6）：39-40.

［6］刘志泉.食品营养学［M］.北京：中国轻工业出版社，1993.

［7］周志江.生物防腐剂及其在食品防腐中的应用［J］.保鲜与加工，2015，15（1）：1-8.

［8］曾涛，陈友高，王灿.HACCP体系在乳制品生产经营中的应用［J］.食品安全导刊，2015（9）：109-110.

［9］VILAR M J，RODRIGUEZ-OTERO JL，SANJUAN M L，et al.Implementation of HACCP to control the influence ofmilking equipmentand cooling tank on them ilk quality［J］.Trends Food Sci Technol，2012，23（1）:4-12.

［10］STANLEY R，KNIGHTC，BODNAR F.Experiences and challenges in the developmentof an organic HACCP system［J］.NJAS-Wage J Life Sci，2011，58（3）:117-121.

［11］WALLACECA，HOLYOAK L，POWELLSC，etal.HACCP-The difficultyw ith hazard analysis［J］.Food Control，2014，35（1）:233-240.

［12］李鸿奎.HACCP在超高温灭菌乳生产中的建立及应用［J］.中国乳业，2014（6）：47-50.

［13］杨朔，夏延斌.HACCP在巴氏杀菌乳中的应用［J］.农产品加工，2008（9）：56-59.

［14］李海燕，乔成亚，龚广予，等.乳酸链球菌素对酸奶品质影响的研究［J］.食品工业科技，2012，33（4）：146-148.

［15］于微，马春丽，孙婷婷，等.产细菌素乳酸菌的筛选及对农家干酪保质期的影响［J］.食品科学，2015，36（3）：142-146.

［16］赵春燕，王源，孟晓曦，等.乳链菌肽的研究现状及应用进展［J］.中国酿造，2010，29（5）：13-15.

［17］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 2760—2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准［S］.北京：中国标准出版社，2014.

［18］王琳，刘聚祥，马亚斌，等.牛奶防腐剂的研究进展［J］.中国乳品工业，2015，43（5）：43-45.

［19］赵瑞香，李元瑞，罗磊.嗜酸乳杆菌生产特性的研究［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2002，30（3）：85-88.

［20］杨天佑，段改丽，赵瑞香，等.嗜酸乳杆菌细菌素Lactobacillin XH1的生物学特性［J］.食品科学，2013，34（17）：197-200.

［21］中华人民共和国卫生部.GB/T 4789.2—2010食品安全国家标准食品微生物检验菌落总数测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［22］李晓东.乳品工艺学［M］.北京：科学出版社，2011.

［23］中华人民共和国卫生部.GB/T 19301—2010食品安全国家标准生乳［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［24］中华人民共和国卫生部.GB/T 19645—2010食品安全国家标准巴氏杀菌乳［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［25］中国乳制品工业协会.RHB 102—2004灭菌乳感官质量评鉴细则［S］.北京：中国标准出版社，2004.

［26］宫智勇，刘建学，黄和.食品质量与安全管理［M］.郑州：郑州大学出版社，2011.

［27］中华人民共和国卫生部.GB/T 2761—2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量［S］.北京：中国标准出版社，2011.

［28］刘皓，王立晖，范兆军，等.HACCP体系在乳粉生产中的应用［J］.食品研究与开发，2014，35（18）：104-107.

Effects of bacteriocin produces by Lactobacillus acidophilus on the shelf-life of fresh milk and the establishment of preservative technology system

WANG Ying，ZHAORuixiang*，MA Yanyan，LIANG Xinhong
（College ofFood Science，Henan Institute ofScience and Technology，Xinxiang 453003，China）

The effectof lactobacillin XH1 from Lactobacillus acidophilus on freshm ilk shelf-lifewas researched.5 g/kg lactobacillin XH1 produced by L.acidophilus wasadded to freshmilk and sterilized freshmilk to analyze thevariation trend ofbacteriostatic activity，acidity，sensory characteristicsduring storage at4℃.Through adding lactobacillin XH1 into sterilized freshmilk，the hazard analysis critical control point（HACCP）system in the corrosion resistanceapplication of sterilized freshm ilkwould be established.The results indicated thatbacteriostatic activity ofm ilk samplew ith lactobacillin XH1 was significantly greater than that ofmilk sample without lactobacillin XH1.The variation trend of acidity was flat，and them ilk still kept the productoriginal sensory characteristics such as flavor，color and textural properties.A fter adding the lactobacillin XH1，the freshmilk shelf-lifewasextended 2 d，and the sterilized freshm ilk shelf-lifewas extended to 4-6 d.The HACCP system lactobacillin XH1 from L.acidophilus in the corrosion resistanceapplication of sterilized freshmilkwasestablished，which couldmake sure theproductsafety.

Lactobacillusacidophilus；bacteriocins；freshm ilk；shelf-life；HACCP

TS201．3

0254-5071（2016）01-0051-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．012

2015-11-18

河南省教育厅科学技术研究重点项目（12A 550004）；河南省科技攻关计划项目（122102110117）；新乡市科技创新平台建设项目（CP1310）

王莹（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

赵瑞香（1966-），女，教授，博士，研究方向为食品生物技术。