增效因子对木醋杆菌产细菌纤维素发酵液中物质变化的影响

贾青慧，卢红梅，，陈　莉，张丽平（.贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550000；.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550000）

增效因子对木醋杆菌产细菌纤维素发酵液中物质变化的影响

贾青慧1，卢红梅1，2*，陈莉2，张丽平2
（1.贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550000；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550000）

在木醋杆菌（Acetobacterxylinum）产细菌纤维素（BC）培养基中，添加一定量的增效因子，考察增效因子椰子水、玉米浆、Tween-80、羧甲基纤维素（CMC）、烟酸和生物素对发酵液中细菌纤维素产量、总糖、总酸和有机酸含量的影响。结果表明，10%玉米浆及60%椰子水对细菌纤维素产量的增效作用最强，细菌纤维素产量分别为8.534 g/L、6.008 g/L，与空白组相比，分别增加了4.67、2.99倍；添加60%椰子水，可以促进总糖含量降低，有利于木醋杆菌合成BC。添加各增效因子后发酵液内总酸含量变化基本一致，整体均呈下降的趋势。10%玉米浆试验组有机酸含量最高，且其中葡萄糖酸、乳酸、乙酸和丁二酸等主体酸所占比例大，这与10%玉米浆对BC产量较为明显的增效作用有一定关系。

细菌纤维素；总糖；总酸；有机酸；增效因子

细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是微生物产生的次级代谢产物，在化学结构和化学组成上与植物纤维相同，但与植物纤维的区别在于细菌纤维素存在形式单一、纯度高、不掺杂木质素或半纤维等其余多糖。BC以单一纤维形式存在且分子取向一致，使其抗张强度、杨氏模量、硬度等高于植物纤维，同时细菌纤维素的超细三维纳米纤维结构（直径在0.01～0.10μm）使其在伸长率、吸湿性、润胀度、柔软性和化学反应活性等方面优于植物纤维。BC还具有成膜性能好、膜抗撕能力强、保水量高、透气、透水性能好及湿强度高等特点［1］，BC的诸多特异性使其可用在很多领域（如作为健康的纤维食品，降低胆固醇［2］；作为优良的人工骨修复材料［3］；用于生产薄形印刷纸，提高印刷性能［4］；利用其超精细结构原位制备有机-无机杂化材料［5］；还可作为酶固定化载体［6］；且细菌纤维素膜在质子交换膜燃料电池领域）具有美很好的应用前景［7］。目前，国内外对于提高BC产量的研究，主要集中在培育高产菌株、优化工艺条件、改进发酵方式和探讨代谢机理等方面［8］，对于发酵过程中的物质变化较少研究，但添加增效因子后，各培养基内生长因子种类、含量存在差异，可能会影响木醋杆菌的代谢，原有物质的消耗和新物质的生成也会不同，而这些不同与BC生成息息相关。

目前，在我国BC主要通过自然发酵椰子水生产，但由于原料具有季节性且自然发酵椰子水成分较为复杂［9］，严重限制了BC的商业化生产。在木醋杆菌产BC的试验中发现，椰子水、玉米浆、Tween-80、羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose CMC）、烟酸和生物素等物质的添加可增加BC产量，本研究通过在木醋杆菌产细菌纤维素发酵液中加入增效因子，对发酵液内细菌纤维素、总糖、总酸、有机酸的含量进行跟踪检测，考察增效因子对发酵液中物质含量变化的影响，以期为进一步研究木醋杆菌合成BC的机理提供理论依据。

1　材料与方法

1.1料与试剂

1.1.1种

木醋杆菌（Acetobacter xylinum）：贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室保藏。

1.1.2料

椰子水为市售椰子破壳取水于冰箱中保藏；玉米浆为市售。

1.1.3剂

氢氧化钠：重庆茂业化学试剂有限公司；盐酸：重庆川江化学试剂厂；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；海藻酸钠、羧甲基纤维素（CMC）、亚硫酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；咖啡因、葡萄糖酸：阿拉丁试剂有限公司；3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市登科化学试剂有限公司；苯酚：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、酒石酸钾钠：成都金山化学试剂有限公司；酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸、丙酮酸（色谱纯）：美国Sigma公司。

1.1.4养基

（1）斜面培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，柠檬酸1g/L，磷酸氢二钠2 g/L，琼脂20 g/L，用蒸馏水配制，121℃灭菌20min。

（2）木醋杆菌液体种子培养基：蔗糖20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁1 g/L，无水乙醇3%，用蒸馏水配制，121℃灭菌20min。

（3）基础培养基：蔗糖50 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨8.0 g/L，磷酸二氢钾4.3 g/L，硫酸镁2.5 g/L，用蒸馏水配制，121℃灭菌20min。

（4）添加物培养基：最适添加量分别为60%椰子水、10%玉米浆、Tween-80 0.8 g/L、CMC 4 g/L、烟酸1.0mg/L、生物素25mg/L，根据基础培养基配方称取所需量的各种物质，用蒸馏水配制，121℃灭菌20min。

1.2器与设备

SPX-250型生化培养箱：上海悦丰仪器仪表有限公司；YXQ-LS-50SI型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；101-1型电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；HH-b型数显恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；FA2004N型精密电子天平：上海菁海仪器有限公司。

1.3验方法

1.3.1养方法

（1）菌种活化：挑取适量原代木醋杆菌转接至木醋杆菌斜面培养基中，28℃静置培养72 h。

（2）液体种子培养：准确量取50m L液体种子培养基于250m L三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却后无菌地加入1.5m L无水乙醇，再接入活化的木醋杆菌3环，置于28℃、100 r/min条件下摇床培养24 h。

（3）静态发酵培养：准确量取50m L发酵培养基于250m L三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却后接入木醋杆菌种子液8%，30℃静置培养8 d。

1.3.2析方法

（1）细菌纤维素产量的测定：将细菌纤维素处理干净，烘干后称其干质量，BC产量计算公式如下：

（2）总糖含量的测定：采用3，5-二硝基水杨酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）比色法测定。

葡萄糖标准曲线的绘制：吸取0、0.2m L、0.4m L、0.6m L、0.8m L、1.0m L、1.2m L、1.4m L、1.6m L葡萄糖标准溶液分别置于25m L比色管中，各加入3，5-二硝基水杨酸溶液2m L，置于沸水浴中煮2min，进行显色，然后以流水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至25m L，摇匀，以试剂空白调零，在波长540 nm处测定吸光度值，以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，以吸光度值（y）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。

样品处理：将发酵液经4 000 r/min离心20min，取上清液5m L于250m L容量瓶中，加入30m L蒸馏水，5m L 6mol/L HCl，70℃水浴15min，冷却至室温，调pH值至7～8，并定容至250m L，作为试样水解液备用。

样品测定：吸取水解液1.0m L，置于25m L比色管中，各加入3，5-二硝基水杨酸溶液2m L，置于沸水浴中煮2min，进行显色，然后以流水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至25m L，摇匀，以试剂空白调零，在波长540 nm处测定吸光度值。以葡萄糖标准曲线回归方程求出样品中总糖含量，总糖含量计算公式如下：

（3）总酸含量的测定

②He was kind of strange, but I liked him.他有点怪怪的，但我还是喜欢他。

采用国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的pH电位滴定法测定样品中的总酸含量。

（4）有机酸含量的测定

有机酸含量的测定采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定。

样液制备：发酵液经4 000 r/m in离心20min，吸取上清液1.00m L，用超纯水稀释至10m L，经0.22μm滤膜过滤，滤液供分析用。

色谱条件：SB-AQ色谱柱（4.6mm×250mm，0.5μm），流动相：97%pH值为2.0的0.02mol/L KH2PO4和3%甲醇，紫外检测波长210 nm，流速0.8m L/min，进样量10μL，柱温30℃，二极管阵列检测器（diodearray detector，DAD）。

有机酸标准溶液配制及标准曲线绘制：准确称取色谱纯、葡萄糖酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸各0.25 g，分别放入25m L容量瓶中，配制成10m g/m L的单标储备液。分别吸取各单标储备液1.00 m L放入10m L容量瓶中，超纯水定容，配成1.00mg/m L的混合标准品。取1.00mg/m L的混合标准品2.00m L、1.00m L、0.50m L、0.20m L、0.10m L分别放入10m L容量瓶中，超纯水定容，配制成不同质量浓度梯度的混标备用。进样前过0.22μm的滤膜。在最佳色谱条件下每个质量浓度进样3次，绘制各有机酸标准曲线。以各有机酸标准曲线回归方程计算样品中有机酸含量。有机酸含量的计算公式如下：

有机酸含量（g/L）=C×K

式中：C为由线性回归方程求得的样液中某有机酸的质量浓度，mg/m L；K为用于分析的样液的稀释倍数。

2　结果与分析

2.1萄糖标准曲线的建立

以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，以吸光度值（y）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，结果如图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线Fig．1 Standa rd curve of glucose

由图1可知，葡萄糖标准曲线线性回归方程为y=0.917 14x-0.007 93，相关系数R2=0.999 49，说明葡萄糖质量浓度和吸光度值二者线性关系良好。

2.2机酸含量标准曲线的建立

采用高效液相色谱法对有机酸标准液进行分析，有机酸标准回归方程、检出限、相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）及回收率结果见表1。

表1　有机酸的回归方程、检出限、RSD和回收率情况Table 1 Regression equa tion，detection lim it，RSD and recovery rate of organic acids

由表1可知，该方法所得各有机酸回归方程的线性相关性好，定量准确、反应灵敏、重现性好、回收率高，适合作为木醋杆菌发酵液中有机酸的分析。

2.3同增效因子对细菌纤维素产量的影响

木醋杆菌产BC的合成过程大致可分为4个步骤：聚合、分泌、组装、结晶［10］。细菌在发酵前期主要依靠磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）提供生产菌体的前体物和能量［11］；发酵后期通过PPP和TCA循环产生较多无效循环，则BC产量不再增加［12］。以基础培养基作为空白对照，各增效因子对BC产量的影响结果见图2。

图2　添加不同增效因子后发酵液中细菌纤维素产量Fig．2 Bacte rial cellulose yield in ferm entation liquor after adding different synergistic factors

由图2可知，添加增效因子后，细菌纤维素产量均有所提高。其中，添加10%玉米浆后BC产量最高，为8.534 g/L，与空白相比，提高了4.67倍；其次是添加60%椰子水后BC产量为6.008 g/L，与空白相比，提高了2.99倍；其他增效因子对BC产量影响不大。结果表明，10%玉米浆和60%椰子水对细菌纤维素产量的增效作用明显。

2.4加不同增效因子后发酵液内总糖和总酸的影响

以基础培养基为空白对照，各增效因子对发酵液中总糖和总酸含量的影响结果见图3。

图3　添加不同增效因子后培养基内总糖（A）和总酸（B）含量变化Fig．3 Changes of totalsugar（A）and totalacid（B）content in culture medium after adding different synergistic factors

由图3A可知，除添加椰子水以外的其他试验组总糖含量变化趋势基本一致，前3 d快速下降，而后趋于平稳，这可能是由于发酵前期木醋杆菌大量繁殖生长，对糖源消耗大，而发酵后期，木醋杆菌生长速度减慢，死亡率增加，菌体少繁殖或不繁殖，或是生成的BC将部分微生物包裹，所以对糖源的消耗也逐渐减少。而添加60%椰子水试验组总糖含量一直处于快速下降趋势，发酵结束时是其他实验组总糖含量的一半，这可能是由于其内含有丰富的营养物质，或营养配比更适合菌体生长，促进了细胞的生长代谢，使微生物细胞一直保持较高活性。因此，添加60%椰子水，可以促进糖源物质的大量消耗，总糖含量降低，总糖消耗率最大（见表2），有利于木醋杆菌合成BC。

表2　添加不同增效因子后发酵液内总糖消耗率Table 2 Consum ption rate of totalsugar in fermentation liquor after adding different synergistic factors

图4　添加椰子水（A）、玉米浆（B）、Tween-80（C）、CMC（D）、烟酸（E）和生物素（F）培养基内有机酸含量的变化Fig．4 Changes of organic acids content in m edium a fter adding coconutwater（A），corn steep liquor（B），Tween-80（C），CMC（D），nicotinic acid（E）and biotin（F）

由表2可知，添加60%椰子水试验组总糖消耗率最大，为66.12%；添加10%玉米浆试验组总糖消耗率为40.88%；而其余组总糖消耗率在30%左右。由此可见，总糖消耗率与各增效因子对BC的增效作用基本一致，总糖消耗率大，BC产量也较高。

由图3B可知，与空白组相比，添加各增效因子后发酵液内总酸变化基本一致，整体均呈下降趋势。这可能是因为木醋杆菌将培养基内的蔗糖转化为酸性物质，使总酸含量上升，随着发酵的进行，部分酸性物质又被木醋杆菌利用，BC不断生成，总酸含量不断下降，发酵后期菌体衰亡、生物活性降低，总酸含量趋于稳定。

2.5加不同增效因子后发酵液内有机酸含量的变化

以基础培养基为空白对照，各增效因子对发酵液中有机酸含量的影响结果见图4。基础培养基内有机酸含量的变化见图5。

图5　基础培养基内有机酸的变化Fig.5 Changes of organic acids content in the basicmedium

由图4和图5可知，各添加增效因子培养基与基础培养基相比，酒石酸、丙酮酸、苹果酸、柠檬酸4种有机酸含量相当，且变化不明显；葡萄糖酸、乳酸、乙酸和丁二酸是主体酸，各培养基主体酸种类基本一致，但含量差异很大。10%玉米浆试验组有机酸含量最高，约是基础培养基的10倍，这与玉米浆对BC产量较为明显的增效作用有一定关系。比较同一培养基内各有机酸含量可知，乙酸含量差异很大，但均呈先增加后降低趋势，这与戴锐等［13］研究结果相一致，并且与总酸变化趋势一致，说明乙酸含量变化是导致总酸含量变化的重要因素，KIYOSHIT等［14］认为乙酸可以改变细菌纤维素的合成途径，是有利于木醋杆菌合成BC的一种物质。丁二酸和乳酸含量高，但变化不明显，其与木醋杆菌合成BC关系不大，与张丽平等［15］研究结果相一致；葡萄糖酸含量最高、变化最明显，变化趋势各不相同，除添加玉米浆试验组葡萄糖酸含量在后期呈快速降低外，其余试验组在发酵后期均呈明显的增加趋势，且在整个发酵周期内忽高忽低，这就说明葡萄糖酸在发酵过程中是微生物代谢产生的一种酸，其在培养基内营养物质较充足时可被微生物利用，且在一定含量范围内有利于木醋杆菌合成BC，但发酵后期葡萄糖酸积累，木醋杆菌合成BC的能力也逐渐降低。

3　结论

本研究在木醋杆菌产细菌纤维素培养基中，添加一定量椰子水、玉米浆、Tween-80、羧甲基纤维素（CMC）、烟酸和生物素等增效因子，在发酵周期内，测定发酵液中BC产量、总糖、总酸以及有机酸含量。结果表明，添加增效因子后发酵液中细菌纤维素产量、总糖消耗率、平均总酸和有机酸含量均有所增加，其中，玉米浆的增效作用最强，细菌纤维素产量为8.534 g/L，与空白组相比，增加了4.67倍；椰子水对发酵液中的总糖消耗率最大，为66.12%。各增效因子对总糖和总酸增效作用与BC产量的变化存在一定的相关性，即对发酵液总糖总酸增效作用强，则BC产量高。对发酵液内有机酸含量的变化进一步研究表明，葡萄糖酸、乙酸、乳酸和丁二酸含量较高且变化较为明显，是发酵过程中的主体酸。其中，乙酸含量变化与总酸含量变化趋势一致，是导致总酸含量变化的重要因素，有利于木醋杆菌合成BC，添加玉米浆后，发酵液中4种主体酸所占比例最大，为90%以上。有机酸的最适添加浓度以及总糖、总酸的增效机理将在后续的试验中继续研究，为BC的实际生产提供相关的理论基础。

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Effect of synergistic factor on the substances change of fermentation liquid with bacterial cellulose-producing Acetobacter xylinum

JIA Qinghui1，LU Hongmei1，2*，CHEN Li2，ZHANG Liping2
（1.School ofChem istry and Chem ical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550000，China；2.SchoolofLiquorand Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550000China）

A certain amountof synergistic factorswere added into the culturemedium of bacterial cellulose-producing Acetobacter xylinum.The effectof coconutwater，corn steep liquor，Tween-80，CMC，niacin and biotin on bacterial cellulose（BC）yield and the contentof totalsugar，totalacid and organic acid were investigated.The resultsshowed that10%corn steep liquor and 60%coconutwater had the strongesteffecton BC yield，and the BC yield were 8.534 g/L and 6.008 g/L，respectively.Compared w ith the blank group，it increased by 4.67 and 2.99 times respectively.Adding 60%coconutwater could reduce total sugar contentsand promote A.xylinum synthesizing BC.A fter adding synergistic factors，the changesof total acid contentwere almost in the same，and appeared a decreasing trend.In the test group of 10%corn steep liquor，the organic acid contentwas the highest，and the proportion of glucose，lactic acid，acetic acid and butyl acid was the largest，which had a certain relationship w ith the effectof 10% corn steep liquoron BC yield.

bacterialcellulose；total sugar；totalacid；organic acid；synergistic factor

Q815

0254-5071（2016）01-0014-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．004

2015-09-11

国家自然科学基金（31160338）；贵州省科学技术基金（黔科合字［2010］2066）

贾青慧（1991-），女，硕士研究生，研究方向为生物质资源化利用。

卢红梅（1967-），女，教授，博士，研究方向为发酵工程以及食品科学。