NQO1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变的相关性研究*

邓燕，徐积兄，殷小龙，易敬林，朱伟锋

（1.南昌大学第二附属医院 儿童眼科，江西 南昌 330006；2.南昌大学第一附属医院 内分泌科，江西 南昌 330006；3.南昌大学附属眼科医院，江西 南昌 330006；4.南昌大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 南昌 330006）

论著

NQO1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变的相关性研究*

邓燕1，徐积兄2，殷小龙1，易敬林3，朱伟锋4

（1.南昌大学第二附属医院 儿童眼科，江西 南昌 330006；2.南昌大学第一附属医院 内分泌科，江西 南昌 330006；3.南昌大学附属眼科医院，江西 南昌 330006；4.南昌大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 南昌 330006）

目的研究NQO 1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变之间的关系。方法根据眼底检查的结果，把546例2型糖尿病患者分成糖尿病视网膜病变组（DR组）和糖尿病无视网膜病变组（NDR组）。采用构象差异凝胶电泳对NQO 1基因C609T多态性进行分型。结果NQO 1基因C609T多态性的CC、CT和TT 3种基因型在DR组的频率分别为29.7%、53.2%和17.1%，在NDR组的频率分别为28.1%、51.8%和20.1%，两组比较差异无统计学意义（c2=0.678，P=0.713）。结论NQO 1基因C609T多态性与我国江西汉族2型糖尿病视网膜病变的发生无关。

糖尿病视网膜病变；依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶；基因多态性

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）作为糖尿病的主要微血管并发症之一，目前已成为工作年龄人群致盲的主要原因之一［1］。DR发病是一个非常复杂的病理过程，受多种因素影响［2］，其中氧化应激被认为与糖尿病视网膜病变的发生密切相关［3］。依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶 ［NAD（P）H：quinine oxidoreductase 1，NQO1］作为影响氧化应激的重要酶，其活性与外显子6上的C609T多态性（rs1800566）密切相关。当此位点由C转变为T时，NQO1蛋白第187位上的脯氨酸转变为丝氨酸，导致该酶活性明显降低［4］。本研究采用聚合酶链反应-构象差异凝胶电泳［5］（polymerase chain reaction-conformation-difference gel electrophoresis，PCR-CDGE）的方法，对NQO1基因C609T多态性与我国糖尿病视网膜病变的相关性进行了研究，报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2011年6月-2013年3月在南昌大学第一附属医院住院546例糖尿病患者。明确诊断为2型糖尿病（均符合1999年WHO糖尿病诊断标准），其中，男性301例，女性245例，年龄30～87岁，平均（59.58±11.24）岁。均为江西地区汉族人，确诊糖尿病时年龄≥30岁，且相互之间无血缘关系。根据是否合并糖尿病视网膜病变分成两组：糖尿病视网膜病变组（DR组）和糖尿病无视网膜病变组（NDR组）。

NDR组满足以下条件：汉族，年龄≥30岁。散瞳检眼镜检查或小瞳下眼底照相检查眼底无异常。排除标准：①有其他严重全身疾病及急性并发症；②非2型糖尿病者；③散瞳下检眼镜检查或小瞳下眼底照相眼底不正常（见DR组）。

DR组满足以下条件：汉族，年龄≥30岁。散瞳检眼镜检查、小瞳下眼底照相检查或眼底血管荧光造影显示：微动脉瘤、任一象限中有＞20处视网膜内出血、在2个以上象限有静脉串珠样改变、在1个以上象限有显著的视网膜内微血管异常、新生血管形成玻璃体积血或视网膜前出血。以上检查出现1项即为存在视网膜病变。排除标准：①有其他严重全身疾病及急性并发症；②非2型糖尿病者。

对入组的研究对象收集临床资料，包括：性别、年龄、民族、出生地和病程，计算体重指数（body mass index，BMI），测量血压，包括收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压（diastolic blood pressure，DBP）。测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、餐后2 h血糖（postprandial two-hour blood glucose，2 hBG）、 糖 化 血 红 蛋 白 （glycosylated hemoglobin，HbA1c）和血脂，包括总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）及尿酸（uric acid，UA）等。

1.2基因组DNA提取

使用百泰克全血基因组DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA［6］，根据琼脂糖凝胶电泳结果，取部分DNA稀释为大约10 ng/μl作为扩增模板。

1.3NQO1基因C609T多态性分型

用PCR-CDGE的方法对NQO1基因C609T多态性进行检测。正向引物：5'-GAAGCCCAGACCAA CTTCTG-3'，反向引物：5'-AGGCTGCTTGGAGCAAA ATA-3'，扩增产物长度为247bp。PCR体系为10μl，包含5μl 2×Pfu Master Mix，10μmol正反向引物各0.2μl，模板1.0μl，ddH2O 3.6μl。扩增条件：94℃预变性3 min；94℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，35个循环；最后72℃延伸5 min。PCR完成后在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行构象差异凝胶电泳分析。

1.4NQO1基因C609T多态性分型的验证

用PCR-RFLP的方法对NQO1基因C609T多态性的分型进行验证。PCR体系为10μl，包含5μl 2×Taq Master Mix，10μmol正反向引物各0.2μl，模板1.0μl，ddH2O 3.6μl。扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性20s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，35个循环；最后72℃延伸5min。酶切体系为15.5μl，包含其中 10×Buffer R1μl，PCR产物5μl，HinfⅠ0.5μl，ddH2O 9μl。在PCR仪上37℃酶切1 h。用2%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，酶切产物上样5μl。当多态性位点为C时，HinfⅠ不能对PCR产物进行酶切，酶切产物仍为247 bp。当多态性位点为T时，247 bp的PCR产物被HinfⅠ切成2个片段：120 bp和127 bp（120 bp和127 bp在2%琼脂糖凝胶上不能分开，表现为在100 bp和200 bp之间1条带）。故酶切后在琼脂糖凝胶电泳上表现为1个较大条带（247 bp）的样本为CC基因型，酶切后在琼脂糖凝胶电泳上表现为1个较小条带（120 bp和127 bp）的样本为TT基因型，酶切后在琼脂糖凝胶电泳上表现为2个条带的样本为CT基因型。对55例样本（约10%）进行酶切。

1.5统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，对于连续型数据，如不符合正态分布，采用中位数和四分位数M（Q25，Q75）表示；符合正态分布且方差齐的数据，两个样本均数的比较用两独立样本t检验，多个样本均数的比较用单因素方差分析；不符合正态分布时，两个样本的比较用Wilcoxon rank sum test，多个样本的比较用Kruskal-Wallis H检验。Hardy-Weinberg平衡检验、基因型频率分布采用c2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1临床资料

根据确立的入组标准，共有546例患者满足以上条件，其中NDR组388例，DR组158例。两组患者的年龄、性别、BMI、SBP、DBP、2 hBG、HbA1c、TC、TG、HDL-C和LDL-C差异无统计学意义。DR组病程长于NDR组，FBG、Scr、BUN和UA高于NDR组，差异有统计学意义。见表1。

2.2NQO1基因C609T多态性的分型结果

构象差异凝胶电泳显示NQO1基因C609T多态性表现为3种情况：迁移率快的1条带、迁移率慢的1条带和2条带。见图1。

图2为NQO1基因C609T多态性247 bp的PCR产物电泳图，PCR产物表现为单一清晰的目的条带，可以用于酶切分型。

酶切结果显示在构象差异凝胶电泳上显示为迁移率快的样本在酶切时都未被切开，为CC基因型，在构象差异凝胶电泳上显示为迁移率慢的样本在酶切时都被切开，为TT基因型，而在构象差异凝胶电泳上显示为2条带的样本在酶切时都有2条带，为CT基因型。见图3。

2.3Hardy-Weinberg平衡检验结果

从表2可知，NDR组和DR组NQO1基因C609T多态性均符合Hardy-Weinberg平衡检验，表明本研究对象具有代表性。

2.4NQO1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变的关系

从表3可知，NQO1基因C609T多态性在NDR组和DR组的基因型频率差异无统计学意义。

表1　两组样本的临床资料比较

2.5NQO1基因C609T多态性位点与糖尿病患者临床资料之间的关系

表4显示NQO1不同基因型的糖尿病患者的临床资料差异无统计学意义。

图1　NQO1基因C609T多态性构象差异凝胶电泳

图2　NQO1基因C609T多态性PCR产物电泳图

图3　NQO1基因C609T多态性酶切产物电泳图

表2　NQO1基因C609T多态性Hardy-Weinberg平衡检验　例（%）

表3　NQO1基因C609T多态性位点在NDR组和DR组的基因型频率　例（%）

表4　NQO 1基因型与临床资料的关系

续表4

3　讨论

近几十年来，受我国城市化进程明显加快、人口老龄化和生活方式改变等因素的影响，我国糖尿病患病率显著增加。最近10年糖尿病流行情况更为严重。根据2007～2008年我国14个城市糖尿病流行病学的调查，估计我国20岁以上的成年人糖尿病患病率为9.7%，成人糖尿病总数达9 240万［7］。我国可能已成为世界上糖尿病患病人数最多的国家。糖尿病视网膜病变作为糖尿病严重和常见的微血管并发症之一，其发生、发展是一个慢性过程，除与血糖控制情况、病程长短、合并全身其他病变、环境因素等有关外，遗传因素也起了重要作用［8-9］。近期国内外的研究表明有多个多态性位点与糖尿病视网膜病变的发生有关［10-11］。视网膜含有较高的多不饱和脂酸，有较高水平的氧摄入量和糖氧化，易于发生氧化应激。研究表明，糖尿病及其视网膜病变患者存在着严重的氧化应激［12］。因此有必要研究氧化应激相关基因多态性与糖尿病视网膜病变之间的关系。

依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶 ［NAD（P）H：quinine oxidoreductase 1，NQO1］是参与氧化应激的重要酶，能催化醌双电子还原反应，从而减少活性氧的产生［13］。NQO1基因C609T多态性是影响NQO1活性最重要的多态性位点，目前在肿瘤方面的研究较多［14］。有研究认为，NQO1基因C609T多态性与2型糖尿病患者冠心病的发生相关［15-16］，但尚无NQO1基因C609T多态性与糖尿病视网膜病变之间关系的报道。

本研究用快速、简便、低成本的PCR-CDGE法对546例2型糖尿病患者的NQO1基因C609T多态性进行分型，结果表明NQO1基因C609T多态性各基因型在DR组和NDR组比较差异无统计学意义。进一步分析NQO1基因C609T多态性各基因型与糖尿病患者临床资料之间的关系，显示NQO1基因C609T多态性不同基因型糖尿病患者的临床资料差异无统计学意义。因此，本研究认为，NQO1基因C609T多态性可能与我国江西汉族人群2型糖尿病视网膜病变的发生无关。而文献中关于NQO1基因C609T多态性与2型糖尿病患者冠心病的发生有关［15-16］，可能是因为NQO1基因C609T多态性在糖尿病大血管病变和微血管病变中所起的作用不同。

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（张蕾编辑）

Association of NQO1 gene polymorphism w ith diabetic retinopathy*

Yan Deng1，Ji-xiong Xu2，Xiao-long Yin1，Jing-lin Yi3，Wei-feng Zhu4
（1.Department of Pediatric Ophthalmology，the Second Affiliated Hospital to Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；2.Department of Endocrinology and Metabolism，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；3.Department of Ophthalmology，Affiliated Eye Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；4.Departmentof Biochemistry and Molecular，Basic Medical College of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China）

Objective To investigate the association of NQO1 C609T polymorphism with diabetic retinopathy. M ethods Based on the results of direct funduscopy detection，546 patients with type 2 diabetes mellitus were divided into 2 groups:diabetic retinopathy（DR）group and non-diabetic retinopathy（NDR）group.NQO1 C609T polymorphism was genotyped by PCR conformation-difference gel electrophoresis（PCR-CDGE）.Results The frequencies of genotype CC，CT and TT at NQO1 C609T polymorphism in DR group and NDR group were 29.7%，53.2%，17.1%and 28.1%，51.8%，20.1%，respectively.No significant difference in genotype between DR group and NDR group was found（c2=0.678，P=0.713）.Conclusions NQO1 C609T polymorphism may not associated with diabetic retinopathy patientswith type 2 diabetesmellitus in Jiangxi Han nationality.

diabetic retinopathy；NQO1；gene polymorphism

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.008

1005-8982（2016）12-0035-06

2016-01-14

江西省教育厅科学技术研究项目（No：GJJ13165）

朱伟锋，E-mail：zwf100@163.com