大鼠认知障碍对糖代谢的影响及其与肝脏和骨骼肌糖原合成酶激酶-3β表达水平的关系*

杜森，叶琳，朱琳，李阳阳，夏春波

（桂林医学院 人体解剖学教研室，广西 桂林 541004）

·论著·

大鼠认知障碍对糖代谢的影响及其与肝脏和骨骼肌糖原合成酶激酶-3β表达水平的关系*

杜森，叶琳，朱琳，李阳阳，夏春波

（桂林医学院 人体解剖学教研室，广西 桂林 541004）

目的探讨大鼠认知障碍对糖代谢的影响及其与肝脏和骨骼肌；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表达的关系，为糖代谢的神经调节机制研究提供新的实验依据。方法Aβ1-42大鼠海马内注射构建认知障碍模型，血糖仪检测大鼠空腹血糖（FPG），半定量反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测肝脏与骨骼肌GSK-3β mRNA的表达，蛋白印迹法（W estern blot）检测肝脏与骨骼肌GSK-3β的表达。结果①实验组大鼠FPG为（7.99±0.15）mmol/L，与假手术组和对照组比较显著升高（P＜0.05）。②实验组大鼠肝脏和骨骼肌GSK-3β mRNA表达水平分别为（0.47±0.03）和（0.26±0.02），与假手术组和对照组比较均明显升高（P＜0.05）。③实验组大鼠肝脏和骨骼肌GSK-3β表达水平分别为（0.47±0.04）和（0.26±0.03），均显著高于假手术组与对照组（P＜0.05）。结论大鼠认知障碍可引起血糖水平的升高，其机制可能与认知障碍大鼠肝脏和骨骼肌GSK-3β表达升高有关。

认知功能障碍；糖代谢；糖原合成酶激酶-3β

老年痴呆是一种常见的慢性神经退行性病变，又名“阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）”。其发生发展与海马功能的受损密切相关，老年痴呆包括轻度认知障碍前期（pre-MCI）、轻度认知障碍期（mild cognitive impairment，MCI）和痴呆期3个时期，且其发展成不可逆转的趋势。AD与糖尿病（diabetes mellitus，DM）关系密切，有些学者称之为“3型糖尿病”［1-2］。有研究显示［3］，81%的AD患者伴随有糖代谢异常。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）在糖代谢的过程中扮有重要的角色，为进一步探讨AD对糖代谢的影响及其与肝脏和骨骼肌GSK-3β表达水平的关系，本实验拟建立大鼠认知障碍模型，探讨其对糖代谢的影响及其与肝脏和骨骼肌GSK-3β表达的关系，为糖代谢的神经调节机制研究提供新的实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

由桂林医学院实验动物中心（合格证号：SCXK桂2007-000）提供健康SD大鼠30只，雌雄不分，体重约200～250 g。水合氯醛由桂林医学院附属医学院提供，微量注射器购自西化仪（北京）科技有限公司，Aβ1-42购自美国Sigma公司，血糖试纸购自强生（上海）医疗器材有限公司，Trizon总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，Rever tAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒购自美国Ther mo公司。由美国Invitrogen公司在GSK-3β、β-actin基因序列上设计并合成引物，GSK-3β正向引物：5'-CACCTGCCCTCTTCAACTTTAC-3'，GSK-3β 反向引物：5'-GGTCTGTCCACGGTCTCCA-3'，产物为158 bp；β-actin正向引物：5'-GAGGGAAATCGTGC GTGAC-3'，β-actin反向引物：5'-CTGGAAGGTGGA CAGTGAG-3'，产物为445 bp。辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，β-actin pAb、GSK-3β pAb购自美国 Bioworld Technology公司。

1.2大鼠认知障碍模型的构建及实验分组

本实验分为实验组、假手术组和对照组，每组10只大鼠。实验组大鼠海马内注射 Aβ1-42 15μg，假手术组海马内注射等体积的PBS缓冲液，对照组不作任何处理。具体操作步骤为：采用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉（3ml/kg），头部备皮，依照大鼠脑立体定位图谱将大鼠固定于脑立体定位仪上，沿其头顶正中切开长约8mm的纵形切口，充分暴露前囟，小型电钻钻开左侧海马上方颅骨（前囟后3.8mm，左旁开2.2mm），不同组别采用微量注射器缓慢垂直进针2.9mm注入相应的试剂，缝合皮肤，并在缝合口处涂抹青霉素，以防感染，继续饲养（每周换3次垫料）。运用Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能。认知功能障碍评定标准：大鼠定位航行时间、跨越平台次数及在原平台象限时间百分比这3项指标中的任意2项与对照组比较差异有统计学意义，则判定为认知功能障碍。

1.3大鼠空腹血糖水平的检测

造模后大鼠继续饲养45 d，利用血糖仪检测大鼠空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG），具体操作方法：大鼠空腹12 h，75%酒精清洁大鼠尾尖，消毒手术剪，剪去少许尾尖，使血液自然流出，按照血糖仪说明书检测大鼠FPG水平。

1.4大鼠肝脏与骨骼肌组织样本采集

采用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉（3ml/ kg），腹部及大腿备皮，打开腹腔和大腿处皮肤，剪取部分大鼠肝脏以及骨骼肌分别装入冻存管，然后快速放入液氮灌中，12 h后将冻存管从液氮灌转移至-80℃冰箱冷冻保存。

1.5RT-PCR法测定肝脏与骨骼肌GSK-3β mRNA的表达水平

从-80℃冰箱取出肝脏（骨骼肌）组织并在液氮中研磨充分，利用Trizon总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度，A260/A280比值在1.8～2.0为最佳，置入-80℃冰箱内短时间冷冻保存备用，用RevertAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒逆转录总RNA最终得到稳定的cDNA，然后分别运用GSK-3β引物和β-actin引物进行PCR扩增，反应条件为：预变性94℃2min，变性94℃ 30 s、退火65℃ 30 s、延伸72℃ 30 s共32个循环，终延伸72℃ 2min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，全自动数码凝胶成像分析系统拍照，计算光密度值并加以分析。

1.6蛋白印迹法（Western blot）法测定肝脏与骨骼肌GSK-3β的表达水平

从-80℃冰箱取出肝脏（骨骼肌）组织并在液氮中研磨充分，加入到盛有适量RIPA组织细胞裂解液的EP管中，充分震荡，静置15min，快速离心并吸取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒检测所提取蛋白质浓度，制备上样蛋白样本，按照步骤：蛋白样本SDS-PAGE电泳→转膜→封闭→TBST洗膜→孵育GSK-3β（β-actin）一抗→TBST洗膜→孵育二抗→TBST洗膜→发光，逐步操作。测定蛋白条带光密度值，并分析。

1.7统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间差异性比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差分析有统计学意义，两两比较用LSD-t或Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1模型建立结果

大鼠饲养45 d后，实验组大鼠死亡1只，存活9只，且表现为体型变瘦，皮毛粗糙，运动迟缓；假手术组大鼠死亡1只，存活9只；对照组大鼠无死亡，存活10只。实验组与对照组大鼠体征无差异。

2.2Morris水迷宫实验对各组大鼠认知功能的检测结果

对各组大鼠运用水迷宫实验检测认知功能结果显示，实验组大鼠定位航行时间为（85.19±2.41）s，明显高于假手术组与对照组的（43.80±10.32）s和（47.20±11.24）s（P＜0.01）；在空间探索实验中实验组大鼠跨越平台的次数、在原平台象限时间百分比分别为（1.78±0.93）次、（18.43±5.75）%，与假手术组和对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；而假手术组与对照组的所有指标比较差异无统计学意义（P1=0.434，P2=0.304，P3=0.061）（见附表）。结果提示本实验构建认知障碍大鼠模型取得良好的效果。

2.3各组大鼠空腹血糖检测结果

利用血糖仪检测大鼠FPG水平结果显示，实验组大鼠FPG为（7.99±0.15）mmol/L，假手术组和对照组分别为（5.36±0.30）和（5.42±0.24）mmol/L，与假手术组和对照组比较，实验组大鼠FPG水平显著增高（P＜0.01），而假手术组和对照组FPG水平比较差异无统计学意义（P=0.895）。

附表　大鼠认知功能检测结果 （）

附表　大鼠认知功能检测结果 （）

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与假手术组比较，P＜0.01

组别跨越平台次数/次对照组（n=10）　47.20±11.24　36.67±3.21　5.67±0.54假手术组（n=9）　43.80±10.32　34.34±4.32　4.94±0.62实验组（n=9）　85.19±2.411）2）　18.43±5.751）2）　1.78±0.931）2）定位航行时间/s原平台象限时间/%

2.4半定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定肝脏与骨骼肌GSK-3βmRNA的表达水平结果

运用RT-PCR法检测各组大鼠肝脏与骨骼肌GSK-3β mRNA表达水平结果显示，实验组肝脏与骨骼肌GSK-3β mRNA表达水平分别为（0.47± 0.03）和（0.26±0.02），与对照组及假手术组比较均显著升高（P＜0.001），假手术组与对照组比较差异无统计学意义（P1=0.066，P2=0.258），其中β-actin扩增产物长度为445 bp，GSK-3β扩增产物长度为158 bp。见图1～3。

2.5Western blot法测定肝脏与骨骼肌GSK-3β表达水平结果

图1　肝脏GSK-3β mRNA的表达

图2　骨骼肌GSK-3β mRNA的表达

图3　肝脏与骨骼肌GSK-3β mRNA的表达情况

运用 Western blot法检测肝脏与骨骼肌GSK-3β表达水平结果显示，实验组大鼠肝脏与骨骼肌GSK-3β表达水平分别为（0.47±0.04）和（0.26± 0.03），与假手术组和对照组比较均明显升高（P＜0.001），而假手术组与对照组比较差异无统计学意义（P1=0.466，P2=0.542），其中β-actin分子量为43 kD、GSK-3β分子量为46 kD。见图4～6。

图4　肝脏GSK-3β的表达水平

图5　骨骼肌GSK-3β的表达水平

图6　肝脏与骨骼肌GSK-3β的表达情况

3　讨论

随着人口老龄化进展加快，AD严重威胁人类的健康，据统计截止到2010年，我国AD患者已达到569万［4］。近年来越来越多研究表明［5］，AD与糖尿病具有复杂的相互关系。目前，糖尿病可促进AD的发生、发展已渐渐被人们所认可，但AD是否可以引起外周血糖水平的异常尚不清楚。SCHULINGKAMP等［6］研究发现，大脑的一些结构如海马、额叶皮质等也可合成并分泌胰岛素，大脑内的胰岛素可以调节血糖的水平、食物的摄入、体重等。RIVERA等［7］认为，AD患者大脑额叶组织中胰岛素水平降低。李钦云等［8］通过126例AD患者研究发现，AD患者存在血糖水平升高以及胰岛素抵抗。有国内学者发现［9］，PD患者认知功能障碍和病情程度可能与血糖水平没有明显的关系，可能与多因素影响血糖水平有关，具体机制有待研究。本研究通过大鼠海马注射Aβ1-42构建认知障碍模型，采用血糖仪检测大鼠FPG水平，结果显示，实验组大鼠FPG水平与假手术组和对照组比较显著升高（P＜0.05），提示大鼠认知功能障碍可能会引起血糖水平升高。

大脑海马不仅是参与学习记忆相关的重要结构，而且其与周围一些脑组织具有广泛的神经纤维联系，例如海马与下丘脑室旁核（PVN）之间具有直接的神经联系，下丘脑－垂体－肾上腺皮质轴（HPA轴）的激活点位于PVN，HPA轴是神经内分泌途径的主要传出通路。有报道，损伤海马的结构如腹侧下脚可增加糖皮质激素的释放［10］。由此可知，海马可参与神经内分泌的调节。XU等［11］研究发现，海马可以通过神经通路参与胃动力的调节。刘梅等［12］通过对SD大鼠海马内微量注射胃动素发现大鼠十二指肠消化间期移行性复合肌电活动发生了显著性的变化，但是当切断膈下迷走神经后海马对十二指肠消化间期移行性复合肌电活动的影响几乎消失，因此，海马可能会通过海马－下丘脑－脑干－迷走神经通路调节胃肠道的运动。

GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，不仅是糖代谢的关键酶，并且参与胰岛素信号通路的调节，GSK-3β可以通过抑制GS的生物活性，从而降低肝（肌）糖原的合成，导致血糖水平升高。本研究通过运用RT-PCR法与Western blot法检测大鼠肝脏与骨骼肌GSK-3β mRNA与GSK-3β的表达水平发现，实验组大鼠肝脏与骨骼肌GSK-3β表达水平与假手术组和对照组比较，均显著升高（P＜0.05），提示认知障碍大鼠血糖水平的升高可能与肝脏和骨骼肌GSK-3β表达水平升高有关。也有研究表明［13］，AD患者大脑内GSK-3β水平及活性显著升高。海马作为大脑边缘系统的重要组成部分可能通过自主神经参与机体调节［12］。推测认知障碍大鼠可能由于海马神经元受损导致其肝脏与骨骼肌GSK-3β表达升高，进而引起血糖水平的上升。认知障碍大鼠出现血糖升高的机制复杂，GSK-3β作为调控糖代谢的关键酶，其表达水平的升高可为海马作为中枢神经系统的一个重要组成部分参与糖代谢调节提供新的依据。

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（张蕾编辑）

Eeffects of cognitive im pairm ent in rats on glucose metabolism and its relationsw ith expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle*

Sen Du，Lin Ye，Lin Zhu，Yang-yang Li，Chun-bo Xia
（Department of Anatomy，Guilin Medical University，Guilin，Guangxi，541004，China）

Ob jective To investigate the effects of cognitive impairment in rats on glucose metabolism and its relation with the expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle，and to provide a new experimental evidence for study of the neural mechanisms regulating glucose metabolism.M ethods The Aβ1-42 was injected into the hippocampus to build cognitive impairmentmodel of rats，and fasting blood glucose of ratswas tested by blood glucosemeter.Expression of GSK-3βmRNA and GSK-3βin liver and skeletalmuscle were detected by RT-PCR and Western blot，respectively.Results In the experimental group，fasting blood glucose（FPG）was（7.99±0.15）mmol/L，which was significantly higher than that in the sham group and the control group（P＜0.05）.The expressions of GSK-3βmRNA in liver and skeletalmuscle of the experimental group were（0.47±0.03）and（0.26±0.02），which were significantly higher than other two groups（P＜0.05）.The expressions of GSK-3βin liver and skeletalmuscle of the experimental group were（0.47±0.04）and（0.26±0.03），which also higher than other groups significantly（P＜0.05）.Conclusions Cognitive impairment in rats causes the elevation of glucose levels，which mechanism may related to the increase of expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle.

cognitive；impairment；glucosemetabolism；glycogen synthase kinase-3β

R 338.26

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.001

1005-8982（2016）12-0001-05

2015-12-20

国家自然科学基金资助项目（No：81260137）

夏春波，E-mail：xiachunbo910@163.com；Tel:13977378285