依达拉奉对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用

高雪花，艾宇航

（1.兰州大学第二医院 重症医学Ⅱ科，甘肃 兰州 730030；2.中南大学湘雅医院重症医学科，湖南 长沙 410008）

论著

依达拉奉对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用

高雪花1，艾宇航2

（1.兰州大学第二医院 重症医学Ⅱ科，甘肃 兰州 730030；2.中南大学湘雅医院重症医学科，湖南 长沙 410008）

目的观察依达拉奉对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用。方法78只清洁级SD大鼠随机分为正常组（Norm组）、假手术组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）、小剂量依达拉奉治疗组（ED 1组）（3mg/kg，静脉注射）及大剂量依达拉奉治疗组（ED2组）（6mg/kg，静脉注射）。盲肠结扎穿孔法制作脓毒症模型，ED1组及ED2组给予依达拉奉治疗。分别于术后3、6及12 h检测各组血清cTn I和心肌·OH-、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、肿瘤坏死因子（TNF-α）及白细胞介素1β（IL-1β）水平，并观察心肌病理形态改变。结果Norm组与Sham组各指标差异无统计学意义（P＞0.05）；CLP组与Norm组及Sham组比较，cTn I、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明显升高，SOD水平明显降低（P＜0.01）；ED 1组及ED 2组与CLP组比较cTnI、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明显降低，SOD水平明显升高（P＜0.01）；ED 2组与ED 1组比较，cTn I、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明显降低，SOD水平明显升高（P＜0.01）。CLP组心肌病理学改变包括间质充血水肿，炎症细胞浸润，心肌纤维断裂、坏死；ED1组及ED2组心肌损伤较CLP组明显减轻。结论①依达拉奉能减轻脓毒症心肌损伤，机制可能与抑制氧化应激及下调炎症因子水平有关；②大剂量依达拉奉（6mg/kg）对脓毒症心肌损伤的保护作用较小剂量（3mg/kg）更明显。

脓毒症；心肌损伤；氧化应激；炎症因子；依达拉奉

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，如合并一个或一个以上器官功能障碍/组织低灌注或低血压则称为严重脓毒症，进一步发展可致脓毒症休克［1］，其发病率和死亡率均很高，是ICU内非心脏病患者的主要死因。心肌损伤是脓毒症常见的并发症，也是影响脓毒症预后的重要因素，有效防治心肌损伤对改善脓毒症预后有重要的意义［2］。然而脓毒症心肌损伤具体机制至今仍不明确，大量研究发现氧化应激及炎症因子可能为重要的致病因素［3-4］。依达拉奉（edaravone）是一种作用机制明确的氧自由基清除剂，在脑梗死及心肌缺血再灌注损伤领域已做了大量的研究［5］。本研究旨在观察依达拉奉对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

清洁级雄性SD大鼠78只，体重（270±20）g，购自中南大学湘雅医院实验动物中心。大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）及白细胞介素1β（IL-1β）定量ELISA试剂盒（R&D，美国）和大鼠·OH-、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购自长沙赛晶生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组与模型制备将78只SD大鼠随机分为正常组（Norm组）、假手术组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）、小剂量依达拉奉治疗组（ED1组）及大剂量依达拉奉治疗组（ED2组）。盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture，CLP）制备脓毒症模型［6］：10%水合氯醛3m l/kg行腹腔内麻醉，固定、消毒、铺巾，腹前正中切口2～3 cm，游离肠系膜和盲肠，以3.0丝线环形结扎盲肠根部，9号针头在结扎线下5mm处贯穿盲肠2次，挤压肠管使粪便自穿刺点溢出，还纳肠管后逐层缝合关腹。ED1组及ED 2组在CLP造模后立即尾静脉分别注射依达拉奉3mg/kg、6mg/kg。Sham组除不结扎和穿刺盲肠外，其余操作同CLP组。术毕各组皮下注射生理盐水30ml/kg以补充体液丢失。

1.2.2标本留取与指标检测血清cTnI：术后3 h、6 h、12 h水合氯醛腹腔麻醉后，开腹自腹主动脉抽血，3 000 r/min离心15min，上清液置入-20℃冰箱保存。按试剂盒说明书酶联免疫吸附法测定。心肌氧化应激指标：①自腹主动脉抽血后立即开胸取心肌组织，冰生理盐水洗净血液后滤纸吸干，放入Ependoff管置入-70℃冰箱保存；②在冰水浴中制备心肌匀浆，4 000 r/min离心15min，上清液按试剂盒说明书测定·OH-、MDA和SOD。心肌炎症因子：上步所得心肌匀浆，按试剂盒说明酶联免疫吸附法检测TNF-α及IL-1β。心肌病理学观察及病理积分：①取一块右心室壁组织，10%中性福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，光镜下观察心肌病理形态变化；②Kishimoto法计算心肌病变积分：每张切片取5个高倍视野，计算每个视野中炎症细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比，无病变计0分，＜25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，＞75%计4分。对心肌病理学变化的评估遵循双盲法原则。

1.3统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M（QL-QU）表示，2组间比较用Mann-Whitney U检验；计数资料以构成比/率表示，两组间比较用χ2检验；Pearson相关分析检验相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血清中cTn I的变化

血清中cTnI的变化见表1：Norm组与Sham组差异无统计学意义（P＞0.05）；CLP组各时间点均明显高于Norm组及Sham组（P＜0.01）；ED 1组及ED 2组较CLP组明显降低（P＜0.01）；ED 2组较ED 1组明显降低（P＜0.01）。

2.2心肌中·OH-、MDA和SOD的变化

心肌中·OH-、MDA和SOD的变化见表2：Norm组与Sham组心肌中·OH-、MDA和SOD水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与Norm组及Sham组比较，CLP组心肌·OH-及MDA水平3 h即明显升高，6 h达到高峰，之后有所降低，SOD水平明显降低（P＜0.01）；ED 1组及ED 2组心肌·OH-及MDA水平较CLP组明显降低，SOD水平明显升高（P＜0.01），但与Norm组及Sham组比较，ED 1组及ED 2组心肌·OH-及MDA水平明显升高，SOD水平明显降低（P＜0.01）；ED 2组与ED 1比较，心肌·OH-及MDA水平明显降低，SOD水平明显升高（P＜0.01）。

2.3心肌中TNF-α和IL-1β的变化

心肌中TNF-α和IL-1β的变化见表3：Norm组与Sham组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与Norm组及Sham组比较，CLP组6 h明显升高，12 h有所下降（P＜0.01）；ED1组及ED2组较CLP组明显降低（P＜0.01），但较Norm组及Sham组明显升高（P＜0.01）；ED2组较ED1组明显降低（P＜0.01）。

2.4心肌病理形态学改变

2.4.1心肌病理形态学改变Norm组及Sham组无明显病理改变（见图1）；LPS组间质充血水肿，炎症细胞浸润，心肌纤维断裂（见图2）；ED1组及ED2组上述病理改变明显减轻（见图3、4）。

表1　血清中cTn I浓度比较 （n=6，）

表1　血清中cTn I浓度比较 （n=6，）

注：1）与Norm组及Sham组比较，P＜0.01；2）与CLP组比较，P＜0.01；3）与ED1组比较，P＜0.01

组别cTn I/（pg/ml）Norm组0.66±0.05 Sham组3 h 0.66±0.05 6 h　0.66±0.06 12 h　0.65±0.05 CLP组3 h 2.01±0.161）6 h　4.08±0.231）12 h　6.48±0.311）ED1组3 h 1.82±0.101）2）6 h　2.51±0.121）2）12 h　3.24±0.131）2）ED2组3 h 1.48±0.131）2）3）6 h　1.89±0.141）2）3）12 h　2.22±0.171）2）3）

表2　心肌中·OH-活性、MDA浓度和SOD活性（n=6，）

表2　心肌中·OH-活性、MDA浓度和SOD活性（n=6，）

注：1）与Norm组及Sham组比较，P＜0.01；2）与CLP组比较，P＜0.01；3）与ED1组比较，P＜0.01

组别OH/（u/mgport）MAD/（nmol/mgport）SOD/（u/mgport）Norm组2.57±0.08 0.22±0.02 6.77±0.38 Sham组3 h 2.85±0.10 0.22±0.03 6.52±0.34 6 h　3.09±0.10　0.24±0.03　6.51±0.37 12 h　3.08±0.11　0.25±0.02　6.49±0.28 CLP组3 h 8.41±0.151）0.62±0.031）3.18±0.211）6 h　10.04±0.161）　0.92±0.041）　2.40±0.221）12 h　9.68±0.151）　0.59±0.041）　3.42±0.261）ED1组3 h 5.93±0.121）2）0.52±0.021）2）4.43±0.271）2）6 h　7.89±0.141）2）　0.70±0.031）2）　4.08±0.291）2）12 h　6.64±0.121）2）　0.54±0.031）2）　4.62±0.291）2）ED2组3 h 5.07±0.101）2）3）0.39±0.021）2）3）5.26±0.251）2）3）6 h　4.32±0.101）2）3）　0.58±0.041）2）3）　4.78±0.231）2）3）12 h　5.82±0.091）2）3）　0.46±0.031）2）3）　5.06±0.231）2）3）

表3　心肌中TNF-α浓度和IL-1β浓度变化（n=6，）

表3　心肌中TNF-α浓度和IL-1β浓度变化（n=6，）

注：1）与Norm组及Sham组比较，P＜0.01；2）与CLP组比较，P＜0.01；3）与ED1组比较，P＜0.01

组别TNF-α/（pg/ml）IL-1β/（pg/m l）Norm组21.02±1.10 4.09±0.17 Sham组3 h 24.70±1.08 4.18±0.17 6 h　25.94±1.15　5.10±0.18 12 h　24.64±1.22　4.82±0.18 CLP组3 h 42.84±1.821）12.33±0.511）6 h　59.03±1.871）　16.41±0.611）12 h　50.86±1.891）　14.64±0.521）ED1组3 h 32.96±1.171）2）10.10±0.451）2）6 h　52.19±1.821）2）　13.99±0.441）2）12 h　45.60±1.721）2）　12.82±0.431）2）ED2组3 h 27.31±1.211）2）3）7.40±0.311）2）3）6 h　48.78±1.451）2）3）　12.10±0.351）2）3）12 h　41.20±1.471）2）3）　10.39±0.331）2）3）

2.4.2心肌组织病理积分CLP组较Sham组明显升高（P＜0.01）；ED 1组及ED 2组与CLP组比较下降（P＜0.01）；ED 2组较ED 1组明显下降（P＜0.01）（见表4）。

2.5血清cTn I与心肌氧化应激指标及炎症因子的相关性分析

血清cTnI与心肌氧化应激指标及炎症因子的相关性分析见表5：cTnI与·OH-及MDA呈正相关，与SOD呈负相关；cTn I与TNF-α及IL-1β呈正相关。

图1　Sham组心肌病理改变 （HE×400）

图2　CLP组心肌病理改变 （HE×400）

图3　ED1组心肌病理改变 （HE×400）

图4　ED2组心肌病理改变 （HE×400）

表4　心肌组织病理积分 （）

表4　心肌组织病理积分 （）

注：1）与Norm组及Sham组比较，P＜0.01；2）与CLP组比较，P＜0.01；3）与ED1组比较，P＜0.01

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表5　血清cTn I与心肌氧化应激指标及炎症因子的相关性

3　讨论

研究发现，脓毒症早期即可发生心肌器质性损伤，常伴有心律失常、低血压和心力衰竭，可进一步加重其他器官损害［7］，防治心肌损伤对改善脓毒症预后有重要的临床意义。

本研究采用CLP法复制大鼠脓毒症模型，RITTIRSCH等［6］认为此法建立的脓毒症动物模型更符合实际的病理生理过程。cTnI是心肌损伤敏感而特异的指标，广泛用于心肌损伤的检测［8］。研究发现脓毒症状态下存在氧化应激［9］。氧化应激指活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生过多和/或代谢障碍造成其大量堆积，引起细胞组织的氧化损伤［10］。·OH-是化学性质最活泼的ROS，也是ROS中诱导生物损伤最重要的成分，破坏性极强。然而自由基活性高，性质不稳定，半衰期短，临床对其直接测定相当困难，通过检测某些氧化产物含量及抗氧化酶活性可有效评价氧化应激状态。生物膜中的多不饱和脂肪酸最易受到ROS攻击而发生脂质过氧化反应，其代谢产物MDA的含量和性质相对稳定，检测方法简便，一直以来被众多国内外学者认为是反应机体氧化应激损伤的重要指标。SOD能催化·O2-发生歧化反应，从而缓解内毒素诱导的白细胞呼吸爆发，减少ROS的生成，其活性高低可反应机体清除氧自由基的能力。TNF-α及IL-1β是脓毒症早期导致心肌损伤的主要致炎因子，两者作用机制相似且相互协同，同时去除血清中的这两种成分，可显著逆转心肌功能障碍［11］。本研究发现，CLP组较对照组cTnI、·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β水平明显升高，SOD水平明显降低（P＜0.01），且cTnI与·OH-、MDA、TNF-α及IL-1β正相关，而与SOD负相关（P＜0.01），表明氧化应激及炎症因子参与了脓毒症心肌损伤。

依达拉奉是作用机制明确的氧自由基清除剂，研究发现其不但可抑制氧化应激，还可降低炎症因子水平［12］，且具有一定程度的剂量依赖性。YAMAZA KI等［13］观察3种不同浓度（1、10及100μmol）依达拉奉对心肌缺血再灌注损伤的干预作用，发现10μmol的干预效果最好。有研究认为，临床使用0.5mg/kg（近似于目前临床推荐剂量，换算为大鼠剂量约为3mg/kg）的依达拉奉其最大血药浓度可达到近6μmol［14］。依达拉奉对脓毒症大鼠心肌损伤进行干预的最佳剂量尚无报道。在预实验中，本实验用不同剂量（1、3、6、9及12mg/kg）依达拉奉对CLP大鼠进行干预，检测血清cTn I同时观察心肌病理形态学改变，结果显示3mg/kg和6mg/kg的干预效果最为理想，因此本实验采用这两个剂量进行研究。结果发现，两种剂量依达拉奉均可降低心肌中·OH-及MDA水平，提高SOD水平，同时可降低心肌中TNF -α及IL-1β水平，减轻心肌损伤，而大剂量组（6 mg/kg）上述指标变化更明显，对脓毒症心肌损伤的保护作用更明显。推测机制可能为，脓毒症状态下氧化应激一旦触发即可级联放大生成大量ROS，ROS又可触发或加重炎症反应，只有将ROS水平降到一定程度才能遏制这种恶性循环，而剂量过大又会引起肝、肾损害等毒副作用，加重器官损伤。但本实验并未行依达拉奉毒副作用的监测，尚不能说大剂量依达拉奉可安全应用于临床，而且，因观察时间较短，也不能说明不同剂量依达拉奉对脓毒症预后有影响。

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（张蕾编辑）

Protective effect of edaravone on sepsis-related m yocardial injury in rats

Xue-hua Gao1，Yu-hang Ai2
（1.Departmentof Intensive Care Unit，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou，Gansu，730030，China；2.Department of Intensive Care Unit，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan，410008，China）

Objective To investigate the protective effectof edaravone on sepsis-related myocardial injury in rats. M ethods Seventy eight healthy male Sprauge-Dawley（SD）rats were random ly divided into normal group（Norm），sham operation group（Sham），sepsis group（CLP），low-dose edaravone treated group（ED1）and high-dose edaravone treated group（ED2）.A ratmodel of sepsis-related myocardial injury was developed by cecal ligation and puncture（CLP）.Edaravone was administered to the rats in ED1 and ED2 group.Serum cardiac troponin I（cTn I）was measured，and hydroxyl radicals（OH-），malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），tumor necrosis factorα（TNF-α）and interleukin-1β（IL-1β）were examined in the heart tissue at various time points（3 h，6 h，and 12 h after operation）.Myocardial pathomorphology was also observed.Results Changes of all indexes were not significantly different between Norm group and Sham group（P＞0.05）.In ED1 and ED2 group，cTn I，OH-，MDA，TNF-α，and IL-1βwere significantly higher than in Norm and Sham group，but lower than in CLPgroup；SOD was significantly lower than in Norm and Sham group，but higher than in CLP group（P＜0.01）.In ED2 group，cTn I，OH-，MDA，TNF-α，and IL-1βwere significantly lower，but SOD was significantly higher than in ED1 group（P＜0.01）.Myocardial pathomorphology in CLP group included edema，congestion inmesenchyma，and inflammatory cells infiltration were not significantly changed in Norm group and Sham group，but alleviated evidently in ED1 group and ED2 group.Conclusions Edaravone alleviates sepsis-related myocardial injury，which probably related to the inhibition of oxidative stress and cytokines.High-dose edaravone（6mg/kg）ismore efficient than low-dose（3 mg/kg）in protective effecton sepsis-related myocardial injury.

sepsis；myocardial injury；oxidative stress；cytokines；edaravone

中国分类号：R 515.3；R-332A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.002

1005-8982（2016）12-0006-05

2015-10-30