两种不同方法检测儿童肺炎支原体感染的对比分析

李正秋，　刘兰香，　刘云花



临床研究

两种不同方法检测儿童肺炎支原体感染的对比分析

李正秋，刘兰香，刘云花

目的 比较血清肺炎支原体抗体ELISA检测和间接血凝试验法，探讨肺炎支原体感染实验室诊断的高性价比方法。方法2013年12月至2015年1月湖南省儿童医院儿科收治住院的支气管肺炎患儿352例，取患儿呼吸道分泌物及血清进行ELISA检测和间接血凝试验，并且对血清进行分离培养，以分离培养作为检测的金标准，比较ELISA检测和间接血凝试验的诊断效果。结果间接血凝实验法的灵敏度为97.5%(159/163)，显著高于ELISA检测法86.5%(141/163)，差异有统计学意义(P<0.05)；ELISA检测法的特异度为91.5%(173/189)，显著高于间接血凝法70.9%(134/189)，差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测法诊断效率为89.2%，Kappa指数为0.782，间接血凝试验法诊断效率为83.2%，Kappa指数为0.670。两组方法诊断效率相近，Kappa指数呈中高度一致。结论ELISA检测和间接血凝实验法各有优势，实验室可按照临床诊断要求选择合适的方法进行检测。

肺炎支原体；分离培养；血清学；免疫；儿童

儿童肺炎支原体感染往往起病缓慢，病程持续长短不一，其致病微生物为肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，MP)，是一种介于细菌和病毒之间的微生物，菌体大小为0.2～0.3 μm，且呈高度多形性[1]，在显微镜下难以鉴定。且其症状、体征无特异性，患儿胸片尚难以与其他致病原所致感染进行区分，因而临床上常常漏诊或误诊，尤其是当病情控制不佳时，因漏诊、使用的抗生素无效而导致的严重并发症常常危及患儿生命。儿童对MP普遍易感，尤其是免疫功能发育不全或低下的患儿常常出现反复感染，为避免错用、滥用抗生素，MP的实验室检查的重要性不言而喻。现临床上的病原学诊断有两大类，一是直接病原体检测，依赖分离培养和PCR法鉴定MP-DNA，其中分离培养和鉴定被认为是感染性疾病诊断的金标准[2]；二是血清学检测，如采用补体结合试验检测MP-IgM，间接血凝试验及酶联免疫吸附法(ELISA)检测IgM、IgG等。本研究拟将间接血凝试验与ELISA检测进行对比，为相关临床决策及医疗实践提供参考。

1　资料与方法

1.1临床资料2013年12月至2015年1月湖南省儿童医院儿科收治住院的支气管肺炎患儿352例，其中男200例，女152例；年龄6个月至12岁；其主要症状为“发热、咳嗽、呼吸急促、伴或不伴有流涕”，主要体征为“肺部能闻及中、细湿性啰音”，X线胸片提示肺纹理增强、片状或斑块状阴影等改变。

1.2诊断标准参照《诸福棠实用儿科学》中支气管肺炎的诊断标准[3]。

1.3纳入标准(1)符合支气管肺炎的诊断标准；(2)年龄6个月至12岁；(3)患儿家属知情同意。

1.4排除标准(1)不固定在本院治疗或中途转院、转诊者；(2)原发性或继发性的免疫缺陷疾病者。

1.5偏倚的控制严格纳入对象的选择标准，取得患儿及家属的合作，提高诊疗依从性，可采用双份样本的方法，及时对照，对技术人员进行培训，按仪器设备要求的环境条件操作，完善质量控制措施。多次复发的患儿只计入一次样本。

1.6方法352例患儿同时进行分离培养、间接血凝实验检查MP-IgM检测痰液MP。具体如下：

1.6.1MP培养[3]取所有患儿鼻咽拭子、痰液或支气管分泌物。培养基中富含足量血清和新鲜酵母浸出液，接种后于37 ℃培养5 d，观察菌落。为提高诊疗效率，即全面充分利用样本，避免反复取材，在进行MP培养外，进行药物敏感试验。

1.6.2间接血凝实验取患儿静脉血2 mL置于采样管内，离心置于冰箱内备用，实验时取血清上清液，进行间接血凝试验。试剂盒购自日本富士MP检测试剂盒(SERODIA——MYCOⅡ)，载体为明胶粒子，按试剂盒说明书严格操作。在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，稀释倍率为1∶64，同时设不含标本的稀释液对照孔。在含稀释标本1滴的板孔(或试管)中，加入0.5%致敏红细胞悬液1滴，充分混匀，置室温1～2 h，即可观察结果。凡红细胞沉积于孔底，集中呈1圆点的为不凝集(-)。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱，以抖凝集的孔为滴度终点。

1.6.3抗MP-IgM ELISA检测方法严格根据ELISA试剂盒的说明书进行操作，样本稀释液中含有IgG/RF吸附剂，要与血清标本充分反应时间超过20 min之后再进行检测。

1.7观察指标灵敏度、特异度、诊断指数、诊断效率、阳性预测值、阴性预测值、漏诊率、误诊率、可用度、约登指数、Kappa指数。诊断指数值越大，诊断试验的应用价值也越大，当诊断指数值≤1的试验应淘汰；诊断效率值俞大，临床应用价值愈好，诊断效率值≤50%的试验应予废弃；患病率相同时，阳性预测值和阴性预测值越接近1，检测方法的诊断价值越高；诊断性试验的可用度波动在0～1之间，一般认为，只有可用度≥0.5的试验才有利用价值；约登指数的取值范围在(-1，+1)，越接近于+1，诊断的正确性越好；Kappa指数用于评价两种检验方法的两次检验结果的一致性，即可重复性检验，是评价可靠性的指标之一，一般认为Kappa指数>0.8则可靠性很好，0.4～0.8表明可靠性中高度一致，<0.4则提示该实验或检测方法的可靠性较差。

1.8统计学方法采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1间接血凝实验法的诊断效果分析见表1。

表1　间接血凝实验法诊断的效果分析(n)

表1结果表明，间接血凝实验的灵敏度为97.5%(159/163)，特异度为70.9%(134/189)，诊断指数为168.4%，阳性预测值为74.3%(159/214)，阴性预测值为97.1%(134/138)，漏诊率为2.5%，误诊率为29.1%，可用度70.49%，约登指数68.4%。

2.2ELISA检测法诊断的效果分析见表2。

表2　ELISA检测法诊断的效果分析(n)

表2结果表明，ELISA检测法的灵敏度为86.5%(141/163)，特异度为91.5%(173/189)，诊断指数为178.0%，阳性预测值为89.8%(141/157)，阴性预测值为88.7%(173/195)，漏诊率为13.5%，误诊率为8.5%，可用度78.07%，约登指数78.0%。

表1、表2可知，间接血凝实验法的灵敏度为97.5%(159/163)，显著高于ELISA检测法86.5%(141/163)，差异有统计学意义(χ2=13.54，P<0.05)；ELISA检测法的特异度为91.5%(173/189)，显著高于间接血凝法70.9%(134/189)，差异有统计学意义(χ2=26.38，P<0.05)。

2.3间接血凝试验检测法和ELISA检测法的可靠性检验见表3。

表3　间接血凝试验检测法和ELISA检测法的可靠性检验

表3结果表明，间接血凝试验检测法和ELISA检测法诊断效率相近，两种检测方法Kappa指数呈中高度一致。

3　讨论

近年来，儿童MP流行有抬头趋势，流行年份可达30%，其一年四季均可发病，发病的高峰在每年的6～10月[3]。由MP造成的感染，因其发病隐匿，临床症状及体征、X线表现与其他病原微生物所致的感染并无特异性，常需依赖于儿科医师根据临床经验做出判断，故不符合循证医学时代的发展要求。其多脏器、多系统并发症，如肾炎、关节炎、心肌炎、免疫性溶血、中枢神经系统受累产生的脑膜炎、脑疝等往往危及患儿生命，产生严重的疾病负担。故能在早期确诊MP感染，有针对性的使用大环内脂类抗生素，是极其重要的环节之一[4]。

MP感染的确诊依赖于MP的实验检测，感染性疾病的金标准是病原体的分离和培养，其可以结合药敏实验[5]，更能对抗生素的临床使用提供科学参考。但由于MP的培养条件挑剔且生长缓慢，其敏感度不高，故而限制了其临床使用范围。血清学方法现阶段有冷凝集试验、补体结合实验、间接血凝实验、ELISA检测IgM、IgG等。冷凝集试验因其非特异性不高，其他病原体的感染仍能提示有阳性结果(如呼吸道合胞病毒、腺病毒感染、衣原体感染等)，因而临床上目前仅为初筛实验，目前已被弃用；间接血凝试验是以红细胞为载体(本法使用明胶粒子作为改良载体)，与待检样品中的抗体相结合，出现肉眼可见的凝集现象，依据此来判断感染与否，本法采用的日本富士MP检测试剂盒(SERODIA——MYCOⅡ)技术成熟，价格成本不高，且阳性率较高，因而使用广泛。其主要检测的血清抗体为抗MP-IgM。本法敏感度较培养法高，但特异度有待商榷，故而易出现假阳性的情况，从而造成误诊。近年来耐红霉素支原体菌株的出现，提示与临床实践中过度使用抗生素有关，因此依据本法在进行抗生素选用时，要注意结果假阳性的可能，应对照细菌耐药实验辅助决策。此外尚有ELISA法检测血清IgM、IgG，叶新明[6]研究指出感染MP的患儿往往血清中IgM出现较早且持续时间较长(在血清中维持在10～16周左右)，该法在MP感染中的早前诊断往往较有临床意义，但血清IgG则出现时间晚，免疫应答慢，因而该法仅能提供回顾性诊断[7]，同时血清特异性抗体IgM常常与患儿的年龄、发育情况、炎症反应程度等有关，为提高诊断准确性，往往需要双份血清抗体滴度4倍及以上方有意义[8]，这无疑增加了取样的难度，同时准确的结果同样与取样的时机密切相关。有研究发现，直接应用P1蛋白和P30蛋白的单克隆抗体通过ELISA方法从患者分泌物、血清中可直接检测到MP特异性抗原[1,8]，该法特异度、敏感度均高，且不受患者自身免疫应答的影响，出现假阳性的情况较普通血清学方法为小，越来越受到科研工作者的关注，但该法仅运用在科学研究领域，尚未推广到临床使用，且其成本较之ELISA检测抗体法显然要大，能否纳入医保制度尚需进一步研究。

间接血凝检测和ELISA检测的灵敏度度分别为97.5%(159/163)和86.5%(141/163)，与胡元生等[9]的研究结果相一致，此外在可靠性检验中，两种实验的Kappa指数均较高，提示分离培养法虽然阳性率低、培养时间长，但其特异度、可靠性高，仍然是感染性疾病诊断的良好指标之一。在直接检测病原体方法中，尚有PCR法直接检测MP-DNA法，该法敏感度高，有较高的约登指数，但要求的实验仪器设备、环境条件、人员操作都较高，样本不能被污染，且检测花费较高，按成本-效益法看不易推广。血液生化学指标同样在MP感染的诊断中发挥重要作用，在检测微生物学感染证据同时，关注血清降钙素原与C反应蛋白等指标[10]，更能对病程进行监控，特别是为抗生素的疗效提供临床观察依据。在MP感染中，血清降钙素原与C反应蛋白等指标的变化提示出MP可能进入血液循环，出现MP血症的可能[11]，因而及时控制感染在MP感染中有重大意义。

本次研究采用的ELISA检测和血凝检测法，成本低，对仪器设备等硬性条件要求不高、操作易于标准化，人员要求低、对技术人员加强培训也有利于质量控制，更有利于在广大基层医疗推广普及。ELISA检测和间接血凝实验法各有优势，实验室可以按照临床诊断要求选择合适的方法进行检测。

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[6]叶新明.儿童肺炎支原体培养与肺炎支原体抗体检测的比较[J].实用临床医学，2008,9(9)：82.

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(本文编辑：刘颖)

A comparative analysis of two different methods for detection of Mycoplasma pneumoniae infection in children

LIZhengqiu，LIULanxiang，LIUYunhua.

DepartmentofNuclearMedicine，HunanChildren'sHospital，Changsha410007，China.

ObjectiveTo compare the serum Mycoplasma pneumoniae antibody ELISA test with indirect blood coagulation test method, and to explore the high cost-effective method in laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection.MethodsTotally 352 cases of bronchial pneumonia in children hospitalized in Department of Paediatrics of Children's Hospital of Hunan Province from December 2013 to January 2015 were included, and respiratory secretions and serum were made ELISA and indirect hemagglutination test, and serum was isolated and cultured. The separate culture was regarded as the gold standard for the detection. ELISA and indirect hemagglutination test were compared on diagnosis effect.ResultsThe sensitivity of indirect hemagglutination test method was 97.5%(159/163), significantly higher than that of ELISA(86.5%,141/163)(P<0.05); The specificity of ELISA method for the detection was 91.5%(173/189), significantly higher than indirect hemagglutination method(70.9%,134/189), the difference being statistically significant(P<0.05). The diagnostic efficiency of ELISA detection method was 89.2%, the Kappa index being 0.782; the diagnostic efficiency of indirect hemagglutination method was 83.2%, and the Kappa index was 0.670. The diagnostic efficiency of the two methods was similar, and the Kappa index was in a high degree of consistency.ConclusionELISA test and indirect blood coagulation test method have their own advantage, so the laboratory can choose the appropriate method according to the clinical diagnosis.

Mycoplasma pneumonia；Separate culture；Serology；Immune；Children

410007 湖南 长沙，湖南省儿童医院核医学科

李正秋(1975-)，男，副主任技师。研究方向：免疫学检测与小儿内分泌的体外检测

李正秋，E-mail：535106686@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.04.017

R725.6

A

1674-3865(2016)04-0423-04

2016-03-17)