祛风止痛颗粒的质量标准研究

陈雪，毕晓黎，，胥爱丽，罗文汇，李素梅，李养学（.广东省中医药工程技术研究院/广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 50095；.广州中医药大学附属广东第二中医院，广东广州50405）

祛风止痛颗粒的质量标准研究

陈雪2，毕晓黎1，2，胥爱丽1，罗文汇1，李素梅1，李养学1
（1.广东省中医药工程技术研究院/广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095；2.广州中医药大学附属广东第二中医院，广东广州510405）

目的建立祛风止痛颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱（TLC）法对方中补骨脂、青风藤进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）对方中补骨脂所含补骨脂素和异补骨脂素的质量分数进行测定，以Agilent Elipse-plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，甲醇-水（体积比43∶57）为流动相，检测波长为246 nm。结果在TLC中能检出补骨脂、青风藤的特征斑点，且阴性对照无干扰。补骨脂素在0.048 3 ～0.482 6 μg范围内，异补骨脂素在0.046 7～0.466 5 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系，r值均为0.999 9，平均加样回收率分别为99.28%、98.78%，RSD值分别为1.69%、0.89%（n=9）。结论所建立的方法简便准确、快速、专属性高、重复性好、结果可靠，可用于祛风止痛颗粒的质量控制。

祛风止痛颗粒；补骨脂素；异补骨脂素；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准

祛风止痛颗粒是由广东省第二中医院名老中医的经验处方加工制成的医院内部制剂，主要由补骨脂、青风藤、秦艽、薏苡仁、独活、续断6味中药组成，具有活血补肾、祛风除湿、舒筋通络功效，可用于治疗关节肿胀、脉络闭阻型风湿性关节炎及类风湿性关节炎等［1］。

类风湿性关节炎多因外有寒邪入侵，内有肾虚而致正气不足。肾为寒水之脏，最易被寒邪所伤，而寒主收引，肾主骨，寒邪入侵导致筋脉挛急、关节不利，故发为类风湿性关节炎。此病病程长、缠绵难愈，久而久之造成虚、瘀、肾伤，因此瘀血阻络为类风湿性关节炎的病理基础，其治疗的根本多为补肾［2-3］。祛风止痛颗粒处方以补肾壮阳、活血化瘀的补骨脂为君药［4］，再以具有祛风湿、通经络之功的青风藤为臣药［5］，对于类风湿性关节炎收效较佳。故本文采用TLC法对处方中的补骨脂、青风藤进行了定性鉴别，同时以君药补骨脂中的特征性成分补骨脂素、异补骨脂素为检测指标［6］，采用HPLC法对处方中所含的补骨脂素、异补骨脂素进行了质量分数测定，为祛风止痛颗粒的质量标准提供了实验依据，为中药颗粒剂质量标准的建立提供了有效参考，更加保证临床用药的安全有效。

1　仪器与试药

1.1仪器

Waters2489高效液相色谱仪（DAD检测器，四元梯度泵，美国 Waters公司），Agilent Elipse-plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（美国Agilent公司）；CAMAG TLC SAMPLER 4型自动点样仪（瑞士CAMA公司）；CAMAG Reprostar 3数码成像系统（瑞士CAMA公司）；Mettler XS205Du电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒公司）；BQ-Ⅱ型薄层自动铺板器（重庆南岸实验电器厂）；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；MilliPore Advantage A10自动纯水机（美国MilliPore公司）；KQ52300DE型数控超声波辅助提取仪（功率500 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴槽（金坛市科析仪器有限公司）。

1.2试药

补骨脂对照药材（批号:121056-200904）、青风藤对照药材（批号:121251-201002）；补骨脂素（批号:110739-201115，质量分数为99.3%）、异补骨脂素对照品（批号:110738-200309，质量分数为100%）均购自中国食品药品检定研究院；祛风止痛颗粒（批号分别为160101、160102、160103）均由广东省第二中医院提供；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2　TLC法定性鉴别

2.1补骨脂的薄层鉴别［6］187

取本品3 g，加乙酸乙酯20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取补骨脂对照药材，加水100 mL，煎煮30 min，放冷，滤过，滤液用适量硅藻土拌样，同法处理作为对照药材溶液。取缺补骨脂药材的阴性样品，同对照药材制备方法制成补骨脂阴性对照溶液。按照薄层色谱法（2015年版《中国药典》四部通则0502）试验，吸取上述供试品、对照药材、阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（体积比4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%（体积分数）KOH甲醇溶液，置紫外灯光（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的2个荧光斑点，阴性对照无干扰。见图1。

图1　补骨脂鉴别的TLC色谱图Figure 1 TLC chromatogram of Psoraleae fructus

2.2青风藤的薄层鉴别［6］195

取本品7 g，加乙醇25 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解。另取青风藤对照药材2 g，加水100 mL，煎煮30 min，放冷，滤过，滤液用适量硅藻土拌样，同法处理作为对照药材溶液。取缺青风藤药材的阴性样品，同对照药材制备方法制成青风藤阴性对照溶液。按照薄层色谱法（2015年版《中国药典》四部通则0502）试验，分别吸取上述供试品、对照药材、阴性对照溶液10、5、10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比2∶4∶2∶1）10℃以下放置的上层溶液为展开剂，置浓氨试液预饱和20 min的展开缸内展开，取出，晾干，喷以碘化鉍钾试液，日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。见图2。

3　补骨脂素、异补骨脂素的质量分数测定［6］187

3.1混合对照品溶液的制备

分别取经P2O5减压干燥器中干燥36 h的补骨脂素、异补骨脂素9.72、9.33 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，即得每1 mL含补骨脂素、异补骨脂素分别为96.52、93.30 μg的混合对照品溶液，放置，备用。

图2　青风藤鉴别的TLC色谱图Figure 2 　TLC chromatogram of Sinomenii caulis

3.2供试品溶液的制备

取祛风止痛颗粒细粉（过3号筛）约1 g，精密称定，置于100 mL具塞的锥形瓶中，加甲醇20 mL，称定质量。加热回流提取20 min，放冷，称定质量，补足减失质量，摇匀，滤过。取续滤液2 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，再取续滤液，即得供试品溶液，放置，备用。

3.3阴性对照溶液的制备

按照处方比例，取除补骨脂外的处方药材，按照处方工艺的制备方法制备，得到1.023 5 g阴性对照样品。取阴性对照样品，同“3.2”项下供试品溶液制备方法制备，得补骨脂阴性对照溶液。

3.4色谱条件与专属性考察［6］187

色谱柱:Agilent Elipse-plus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相:甲醇-水（体积比43∶57）；流速: 1 mL/min；柱温:25℃；检测波长:246 nm；进样量: 10 μL。

分别精密吸取上述混合对照品、供试品（批号: 160101）、阴性对照溶液10 μL，按上述色谱条件进行测定，结果理论板数以补骨脂素、异补骨脂素峰计算应不低于3 000；阴性对照溶液在补骨脂素、异补骨脂素色谱峰位置上无干扰，表明方法专属性好，见图3。

3.5线性关系的考察

精密吸取补骨脂素、异补骨脂素混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，振匀，制成补骨脂素质量浓度分别为4.83、9.65、19.30、28.96、38.61、48.26 μg/mL，异补骨脂素质量浓度分别为4.67、9.33、18.66、27.99、37.32、46.65 μg/mL的系列对照品溶液。依次进样10 μL，按“3.4”项下色谱条件测定并记录峰面积。分别以补骨脂素、异补骨脂素峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标进行线性回归，得补骨脂素、异补骨脂素回归方程分别为Y1=7.900× 103X1+1.170 0×104（r1=0.999 9）、Y2=7.410×103X2+1.030 0×104（r2=0.999 9）。结果表明补骨脂素在0.048 3～0.482 6 μg，异补骨脂素在0.046 7～0.466 5 μg范围内，线性关系良好。

图3　混合对照品（A）、供试品（B）、阴性对照（C）溶液的HPLC色谱图Figure 3 HPLC chromatograms of reference substances（A），test sample（B）and negative control（C）

3.6精密度试验

取同一批（批号:160101）祛风止痛颗粒约1 g，精密称定，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，测定峰面积，结果补骨脂素、异补骨脂素峰面积的RSD值分别为1.10%、1.12%（n=6），表明仪器精密度良好。

3.7稳定性试验

取同一批（批号:160101）祛风止痛颗粒约1 g，精密称定，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0、2、6、8、12、24 h时进样，按“3.4”项下色谱条件进行测定。结果补骨脂素、异补骨脂素峰面积积分值的RSD值分别为1.31%、1.34%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.8重复性试验

取同一批（批号:160101）祛风止痛颗粒约1 g，精密称定，共6份，分别按“3.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.4”项下色谱条件进行测定，计算补骨脂素、异补骨脂素质量分数。结果测得补骨脂素、异补骨脂素的平均质量分数分别为266.34、322.20 μg/g，其RSD值分别为0.41%、0.52%（n=6），表明方法重复性良好。

3.9加样回收率试验

取9份已知补骨脂素、异补骨脂素质量分数（分别为 266.34、322.20 μg/g）的同一批（批号: 160101）祛风止痛颗粒，每份约0.5 g，精密称定，每3份为1组。每组分别精密加入新配制的混合对照品溶液（补骨脂素、异补骨脂素质量浓度分别为66.59、80.55 μg/mL）1、2、3 mL，挥干，分别按照“3.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.4”项下色谱条件测定并计算回收率，结果见表1～表2。

表1　祛风止痛颗粒中补骨脂素的加样回收率试验结果Table 1 Recovery results of psoralen in Qufeng Zhitong granules

表2　祛风止痛颗粒中异补骨脂素的加样回收率试验结果Table 2 Recovery results of isopsoralen in Qufeng Zhitong granules

3.10样品的测定

分别取3批（批号:160101、160102、160103）祛风止痛颗粒，各约1 g，精密称定，每批平行操作2份。分别按“3.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.4”项下色谱条件进行测定，计算得3批祛风止痛颗粒中补骨脂素的质量分数分别为266.34、265.35、265.78 μg/g；异补骨脂素的质量分数分别为322.20、321.85、322.80 μg/g。

4　讨论

本试验对处方中的补骨脂和青风藤进行了薄层鉴别，首先按照2015年版《中国药典》［6］187，195的方法进行了试验，斑点清晰可见、分离度良好，且阴性对照无干扰，故可列入标准。

本试验对补骨脂提取方法进行了考察，首先按2015年版《中国药典》的方法（加甲醇索式提取2 h）［6］187进行提取。索氏提取所用时间相对较长，为了缩短实验时间、提高实验效率，考虑采用其他方法进行提取，本文分别对索氏、超声和加热回流这3种提取方法进行了考察。结果显示:超声提取法提取率不高，索氏提取与回流提取效果相当，但回流提取所用时间更短；故最终确定采用加热回流法进行提取。又经过优化提取时间和提取溶剂体积，最终确定最佳提取方法为加甲醇20 mL，加热回流20 min。

参考2015年版《中国药典》［6］187，对补骨脂素和异补骨脂素测定时流动相的比例、色谱柱、流速、柱温等色谱条件进行了考察，通过线性范围、专属性、加样回收率等方法学验证，确定本方法稳定、精准、专属性强，可作为祛风止痛颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的质量分数测定方法。

［1］衣蕾，雷媛琳，吉海旺，等.补肾活血祛风法联合甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎 66例［J］.陕西中医，2010，31 （6）:698-670.

［2］衣蕾，姜小帆，李娟娥.吉海旺教授分期辨证治疗类风湿关节炎经验［J］.风湿病与关节炎，2012，1（6）:60-62.

［3］姜婷，汪荣盛，茅建春.浅谈从肾论治类风湿关节炎［J］.风湿病与关节炎，2013，2（2）:40-43.

［4］林清，李劲平，栗会敏，等.补骨脂的研究进展［J］.咸宁学院学报（医学版），2012，26（2）:175-177.

［5］董文燊，瞿发林.青风藤药理作用及制剂临床应用研究概况［J］.天津药学，2012，24（2）:76-78.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2015.

（责任编辑：刘晓涵）

Study on quality standard of Qufeng Zhitong granules

CHEN Xue2，BI Xiaoli1，2，XU Aili1，LUO Wenhui1，LI Sumei1，LI Yangxue1
（1.Guangdong Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine/Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development of Guangdong Province，Guangzhou 510095，China；2.Second Chinese Medicine Hospital of Guangdong Province，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Objective To establish the quality standard of Qufeng Zhitong granules.Methods TLC was used for the qualitative identification of Psoraleae fructus and Sinomenii caulis.Agilent Elipse-plus C18column was used with the mobile phase of methanol-water（43∶57），and the detection wavelength was set at 246 nm.Results The TLC spots were clear and well-separated without interference of negative samples.The linear relationship of psoralen was good within the range of 0.048 3-0.482 6 μg（r=0.999 9），and the linear relationship of isopsoralen was good at the range of 0.046 7-0.466 5 μg（r=0.999 9）.The average recoveries were 99.28%（RSD=1.69%）and 98.78%（RSD=0.89%）（n=9），respectively.Conclusion The method is simple and accuracy，quick，highly specific and reliable with good repeatability，which could be used for the quality control of Qufeng Zhitong granules.

Qufeng Zhitong granules；psoralen；isopsoralen；TLC；HPLC；quality standard

药理学

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0462-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016033001

2016-03-30

广东省医疗机构中药制剂研发技术平台建设（2013B040200040）

陈雪（1989—），女，2014级硕士研究生，Email:18898606478@163.com，从事中药质量评价研究；通信作者:毕晓黎（1979—），女，博士，主任中药师，硕士研究生导师，从事中药质量评价研究。

网络出版时间:2016-07-06 10:37 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160706.1037.001.html