血根碱与c-myc G4-DNA相互作用的光谱法研究

胡颖智，沈海辉，邬期望，沈宏，孙悦（1.广东药科大学中药学院，广东 广州510006；2.国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东广州510006；3.广东高校中药质量工程技术研究中心，广东广州510006；.浙江大学微分析系统研究所，浙江杭州310058）

血根碱与c-myc G4-DNA相互作用的光谱法研究

胡颖智1，2，3，沈海辉1，2，3，邬期望4，沈宏4，孙悦1，2，3
（1.广东药科大学中药学院，广东 广州510006；2.国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东广州510006；3.广东高校中药质量工程技术研究中心，广东广州510006；4.浙江大学微分析系统研究所，浙江杭州310058）

目的研究血根碱与c-myc G4-DNA的相互作用。方法采用紫外可见吸收光谱、圆二色谱、变温试验等方法，对血根碱与c-myc G4-DNA的结合常数、结合比例、结合模式及稳定性进行研究。结果在紫外可见吸收光谱中，血根碱在300～350 nm之间的特征吸收峰随c-myc G4-DNA浓度的增加出现明显的减色效应和红移，减色率ΔH=35.4%（Δλ=7 nm），与c-myc G4-DNA结合常数为3.1×104mol/L；G-四链体/血红素过氧化物酶竞争试验中，血根碱竞争血红素引起吸光度下降；变温试验中c-myc G4-DNA的熔点在血根碱作用下升高4.7℃。结论血根碱以结合比例为1∶1外部堆积于c-myc G4-DNA，并促使其结构稳定，这可能是血根碱抗肿瘤的分子机制之一。

血根碱；c-myc G4-DNA；相互作用

四链螺旋结构的核酸称为 G-四链体（G-quadruplex），4个鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键配对形成G平面（G-tetrad），适当体积的阳离子或配体可以促使多个G平面堆叠形成G-四链体结构，能够与G-四链体特异性结合并使之稳定的化合物可通过降低原癌基因的转录表达而达到抗肿瘤的效果［1］。c-myc是体内重要的原癌基因之一，研究表明c-myc启动区DNA形成的G-四链体已经成为抗肿瘤药物研究的靶点［2-4］。

血根碱（sanguinarine，San）是一种在白屈菜含量较高的生物碱，课题组前期试验［5］和许多体外试验证明，血根碱能通过诱导细胞凋亡而抑制不同来源的癌细胞生长，包括肝癌、人鳞状细胞癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌等癌细胞［6］。血根碱还是一种细胞周期的阻断剂，是一种潜在的抗癌药物［6］。JI Xiaohui等［7］研究表明血根碱可与C-myc22形成的G-四链体结合，诱导G-四链体的形成并提高其稳定性，但缺乏深入研究。本文用G-四链体/血红素过氧化物酶竞争试验结合光谱法进一步探讨了血根碱与c-myc G4-DNA的结合模式，并测得血根碱与c-myc G4-DNA的结合常数和结合比例，为以G-四链体为靶点的新型抗肿瘤药物的设计提供依据。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

K640型热循环仪（杭州晶格科学仪器）；UV-2200PC型紫外-可见分光光度仪（上海舜宇恒平科学仪器公司）；SC-15型数控恒温槽（宁波新芝生物科技公司）；MOS-450圆二色谱仪器型号（法国BioLogic Science Instrument）。

c-myc G4-DNA为 C-myc22（5′-TGAGGGTGG GGAGGGTGGGGAA-3′）、HT4（5′-TTAGGGTTAGGG TTAGGGTTAGGG-3′）、Pu27（5′-TGGGGAGGGTGG GGAGGGTGGGGAAGG-3′）均购于英潍捷基上海贸易有限公司；血根碱（San，质量分数＞98%，阿拉丁试剂公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、30%过氧化氢（H2O2）、血红素（hemin）、二甲基亚砜（DMSO）、KCl（均为分析纯，上海国药集团有限公司）。DNA用缓冲液（pH7.4，10 mmol/L Tris-Hcl）配制成100 μmol/L的储备液，分装后于-20℃储存；hemin溶于DMSO，配制成500 μmol/L储备液，储存于-20℃；KCl溶液用缓冲液配置成500 μmol/L。DNA退火:DNA储备液分别使用无K+和有K+缓冲液稀释，置于热循环仪95℃加热10 min，缓慢冷却至室温形成DNA溶液。

1.2ABTS-H2O2显色体系试验［8］

显色试验样品总体积为2.5 mL，向比色皿加入50 μmol/L DNA溶液100 μL，加入20 μmol/L hemin 250 μL，加入缓冲液2 100 μL，混合均匀后在恒温槽37℃孵育1 h，向样品中分别加入25 μL 40 mmol/L ABTS和H2O2。未加DNA为空白组，10 min时测定415 nm的吸光度。

1.3血根碱与C-myc22结合常数试验［9-10］

参比池加入缓冲液，样品池中加入10 μmol/L血根碱溶液3 mL。每隔5 min用微量移液器分别往参比池和样品池比色皿中加入2 μmol/L C-myc22溶液，使C-myc22与San浓度比值按一定比例递增，在300～500 nm扫描吸收谱图。

1.4血根碱与C-myc22结合比例试验［11］

保持San与C-myc22溶液总浓度10 μmol/L不变，改变体系中 San与 C-myc22的比例。测定327 nm的吸光度值，以相应浓度的血根碱溶液作为空白对照，扣除空白后，以血根碱的含量作Job plot图。数据用Origin 8软件处理。

1.5血根碱与C-myc22结合模式试验［8］

G-四链体/Hemin过氧化物酶表征试验由紫外测定，向C-myc22溶液中加入hemin，37℃孵育1 h，即得具有过氧化物酶活性的DNA酶。再向溶液中加入San，使得溶液中hemin、C-myc22、K+和San成特定浓度比，37℃反应1 h。在360～460 nm扫描紫外吸收光谱图。

G-四链体/Hemin过氧化物酶竞争试验中样品总体积2.5 mL，向比色皿加50 μmol/L C-myc22 G-四链体溶液50 μL，加入10 μmol/L hemin 250 μL，加入缓冲液1 900 μL，混合均匀后37℃孵育1 h，接着分别加入20 μmol/L和100 μmol/L San各250 μL，混合均匀后37℃孵育1 h，向样品中分别加入40 mmol/L ABTS和40 mmol/L H2O2各25 μL。测定样品在10 min内415 nm处的吸光度变化。

1.6变温试验

配制一定浓度的C-myc22溶液、含有血根碱的C-myc22溶液以及空白溶液，加入到带有控温装置的石英比色池中（光程10 mm），经过脱气，塞上四氟乙烯以防止溶液在高温蒸发。待吸光度稳定后，以缓冲液或相同浓度的血根碱作参比，以0.25℃/min速度增温，测定295 nm处、不同温度下的吸光度。

1.7圆二色谱试验

C-myc22分别与一定比例的K+、hemin和 San混合均匀，37℃孵育1 h后，将样品溶液加入到光径1 cm的石英比色皿，从220 nm扫描至320 nm，扫描速率100 nm/min，带宽10 nm，读数3次，响应时间1 s，测定光谱均扣除空白组。

2　结果与分析

2.1DNA链的选择

血根碱与不同DNA链形成的G-四链体均有结合，如端粒链HT4［12］、启动区Pu27［13］和C-myc22［7］，为找到对光谱法分析灵敏的链，采用ABTS-H2O2显色体系对这3条DNA链与血红素形成的G-四链体-hemin DNA酶催化活性进行了比较，如图1。可见，无K+情况下，这3条DNA与血红素结合后都表现出微弱的催化活性，而有K+组中，DNA酶催化活性明显提高，说明K+对G-四链体的形成至关重要。其中 C-myc22形成的 DNA酶催化活性最高，且C-myc22形成的G-四链体结构单一，核磁谱图清晰，结构解析完全，因此在文献［14］中以C-myc22为靶点，进行药物设计与筛选。梅文杰课题组［10，15-16］也以C-myc22为抗肿瘤药物靶点进行研究。综上所述，C-myc22形成的DNA酶催化活性高利于光谱法分析，且研究它与血根碱的相互作用可探讨血根碱的抗肿瘤机制，所以选择C-myc22链作为研究对象。

图1　3种DNA酶催化活性的比较Figure 1 Comparison of three DNAzyme catalytic activity

2.2血根碱与C-myc22的结合常数

紫外-可见光谱法是研究G-四链体和化合物相互作用最常用的方法，通常化合物与DNA结合后最大吸收峰会有谱带变化，以此来判断化合物与DNA是否结合，从图2可知血根碱加入C-myc22后发生了7 nm红移（从327 nm至334 nm），并伴随着35.4%的减色现象，通过下列方程计算出血根碱与C-myc22相互作用的结合常数Kb:

式中:DNA代表DNA的浓度；εa、εf、εb分别代表在不同 C-myc22浓度溶液中，游离的和与C-myc22键合饱和的血根碱的摩尔吸光系数；Kb可由拟合直线与y轴相交的截距求得，在试验条件下，计算得到结合常数Kb为3.1×104mol/L，说明血根碱与C-myc22有较强的结合作用［8-9］。

图2　血根碱与不同浓度C-myc22相互作用后的紫外吸收光谱图Figure 2 Absorption spectra of San in the presence of increasing amounts of C-myc22

2.3血根碱与C-myc22的结合比例

Job plot分析试验即保持血根碱与G-四链体的总浓度不变，连续改变血根碱与G-四链体的浓度比，在不同的浓度比下的测定体系吸收信号，以此来确定 G-四链体与血根碱结合的化学计量比［8，11］。从图3可见，随着体系中血根碱比例的增加，吸光度减少程度先变大后变小，交叉点是0.5，表明血根碱与C-myc22的结合比为1∶1。

图3　血根碱与C-myc22相互作用的Job plotFigure 3 The Job plot of San with C-myc22

2.4 血根碱与C-myc22的结合模式

血红素卟啉环在400 nm波长附近有紫外吸收，即Soret带，当血红素与G-四链体结合形成DNA酶后，Soret带会产生增色红移现象，可表征G-四链体/ Hemin过氧化物酶。如图4所示，血红素的特征吸收波长为397 nm（曲线a），当血红素与C-myc22作用后，Soret带有红移（7 nm）及增色现象（曲线b），这与文献［17］报道的血红素与G-四链体亲合作用结果一致，说明C-myc22在无K+的情况下也能形成G-四链体；在有K+组中，血红素与C-myc22反应的红移及增色比无K+组明显增强（曲线c），说明K+能大量促进C-myc22形成G-四链体，加入血根碱后红移增色现象减弱（曲线d），表明血根碱竞争血红素与G-四链体的结合。

图4　血红素、C-myc22和San紫外可见吸收光谱Figure 4 UV-visible absorption spectra of San/C-myc22/ hemin complex

Hemin通过外部堆积的方式与G-四链体结合，G-四链体/hemin复合物可催化H2O2氧化ABTS2-。其他分子如能与 G-四链体结合，且结合位点与hemin相同，则能与 hemin竞争，使得 G-四链体/ hemin复合物减少，导致体系的颜色变浅，吸光度下降［8］，因此可用G-四链体/hemin过氧化物酶竞争试验判断结合模式。由图4可见，血根碱能与hemin发生竞争关系。C-myc22和血红素体系中加入不同浓度血根碱，血根碱浓度越高，体系催化活性也越低（见图5），说明San与hemin有竞争作用，降低了G-四链体/hemin过氧化物的酶活性。

从上述紫外光谱试验和DNA酶催化H2O2氧化ABTS2-试验结果均可推断:在与G-四链体的结合中，San与hemin是竞争关系，hemin是通过外部堆积的方式与G-四链体结合，因此推断血根碱与G-四链体的结合模式也为外部堆积。

2.5变温试验

变温试验检测G-四链体通常是测定295 nm吸收，可以得到G-四链体结构存在与否以及化合物能否稳定G-四链体结构［11］。从图6中可见，随着温度的升高，295 nm熔融曲线都形成倒“S”曲线，说明均有G-四链体存在；无 K+组，C-myc22的 Tm值为31.5℃；有K+组，熔点Tm为74.8℃，明显增大，是K+进入G-四链体平面中间，促进了G-四链体的稳定性［18］；有K+组加入San后，Tm为79.5℃，额外增加了4.7℃，说明San与C-myc22结合并增加其结构的稳定性。

图5　血根碱抑制G-四链体-hemin DNA酶催化活性Figure 5 Inhibition effect of San on activity of G-quadruplexhemin DNAzyme

图6　C-myc22与K+、San的变温试验图谱Figure 6 The melting temperature experiment of C-myc22 with K+and San

2.6圆二色谱表征G-四链体

CD是研究G-四链体构型和G-四链体与化合物相互作用的重要方法之一，平行型和反平行型G-四链体各自具备不同的CD特征谱图，平行G-四链体结构出现265 nm正峰和240 nm负峰［10］。从图7可知，C-myc22无K+能自身形成平行G-四链体（曲线a）；当加入10 mmol/L K+时，240 nm负峰明显降低，265 nm正峰增高（曲线b），说明K+促进C-myc22形成平行G-四链体结构；hemin和San加入后，CD谱图均没有变化（曲线c和d基本相同），而有K+组，San能促进C-myc22形成G-四链体［7］。以上说明San对G-四链体结构没有破坏或诱导构型转变作用，并且与K+进入G-四链体平面之间不同，有可能与hemin一致，以外部堆积形式与G-四链体结合。

图7　C-myc22与K+、hemin、San相互作用CD谱图Figure 7 CD spectra of interaction between K+，hemin，San and C-myc22

3　结论

本文研究了血根碱与C-myc22的相互作用，K+进入相邻的G-四链体平面中间，促进C-myc22形成G-四链体，紫外分光光度法测得血根碱与C-myc22结合常数为3.1×104mol/L，结合比例为1∶1。采用G-四链体/hemin过氧化物酶竞争试验和紫外光谱法证明血根碱与G-四链体结合模式为外部堆积，变温试验表明K+和血根碱促进G-四链体结构的稳定性，圆二色谱中血根碱没有使G-四链体结构发生改变，佐证了血根碱与G-四链体结合模式为外部堆积。血根碱抗肿瘤作用可能与c-myc密切相关，具体的作用机制还有待进一步研究阐明。

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（责任编辑：陈翔）

Study on the interaction between c-myc G4-DNA and sanguinarine by spectrometry

HU Yingzhi1，2，3，SHEN Haihui1，2，3，WU Qiwang4，SHEN Hong4，SUN Yue1，2，3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University；2.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，China；3.Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou，510006；4.Institute of Microanalytical Systems，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

Objective To study the interaction between sanguinarine and c-myc G4-DNA.Methods The binding constants，binding modes，binding ratio and stabilization of sanguinarine with c-myc G4-DNA were studied by UV-Vis spectroscopy，circular dichroism，and melting temperature experiment method.Results In UV-Vis spectroscopy，it was found that there was a hypochromise of 35.4%（Δλ=7 nm）at the characterized absorption of sanguinarine in the presence of c-myc G4-DNA，and the binding constants value was 3.1×104mol/L.In G-quadruplex/hemin peroxidase competition experiment，sanguinarine competed with the hemin to bind with G-quadruplex，which led to a decrease of absorbance.The melting point of cmyc G4 DNA was increased about ΔTm=4.7℃ in melting temperature experiment.Conclusion sanguinarine can increase the stability of c-myc G4-DNA，and bind with c-myc G4-DNA at a ratio of 1:1 by external stacking，which may be one of the antitumor mechanisms of sanguinarine.

sanguinarine；c-myc G4-DNA；interaction

R914

A

1006-8783（2016）04-0431-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051706

2016-05-17

国家自然科学基金（81001600）；浙江省自然科学基金（LY16B050004）

胡颖智（1991—），女，2014级硕士研究生，从事微流控分析与中药分析研究，Email:hyztournesol@sina.com；通信作者:孙悦（1977—），女，博士，教授，从事微流控分析与中药分析研究，Email:sunyuesdzb@163.com；沈宏，男，博士，副教授，主要从事分析化学研究，Email:shzju@zju.edu.cn。

网络出版时间:2016-07-011 14:56 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1456.006.html