白花蛇舌草总RNA提取方法比较与优化

陈艳琳，王颖芳（广东药科大学中药学院，广东广州510006）

白花蛇舌草总RNA提取方法比较与优化

陈艳琳，王颖芳
（广东药科大学中药学院，广东广州510006）

目的探索白花蛇舌草总RNA最佳提取方法。方法以广东产白花蛇舌草为材料，选用Trizol法、多糖多酚总RNA提取试剂盒（RNA prep Pure Plant Kit）、植物总RNA提取试剂盒、改良CTAB法、RNAiso Plus法提取蛇舌草根和叶总RNA，经琼脂糖凝胶电泳及Aligent 2100检测，比较5种提取方法所得总RNA的完整性、纯度及产率。结果RNA prep Pure Plant Kit及植物总RNA提取试剂盒均能提取到总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S条带清晰，前者亮度高于后者。RNA prep Pure Plant Kit中D（γ）260 nm/D（γ）280 nm和D（γ）260 nm/D（γ）230 nm值均在2.0左右，叶片组织RNA质量浓度为390.35 mg/L，经Aligent 2100检测，28S条带亮度是18S的2倍。改良CTAB法所得RNA 28S和18S条带稳定清晰，但受基因组污染严重。RNAiso Plus和Trizol法无法完成蛇舌草总RNA的提取。结论 不同植物、不同品种或同一植物不同部位皆存在属性差异，要根据植物特性选择合适的RNA提取方法。RNA prep Pure Plant Kit提取蛇舌草根、叶片RNA效果较优，可满足后续试验要求。

白花蛇舌草；总RNA；提取方法

白花蛇舌草最早载于《广西中药志》，来源于茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.，以干燥全草入药［1］，别名蛇舌草、蛇刺草、羊须草等。本品性寒，味苦、甘，具有清热解毒、利尿消肿、活血止痛之功效，临床应用广泛。现代药理研究揭示白花蛇舌草具有抗菌消炎、抗肿瘤作用［2-3］。2015年版《中国药典》只收载了白花蛇舌草的复方制剂，其原料药材未收载在内［4］，《广西中药志》等地方药材标准仅简要介绍白花蛇舌草的理化鉴别及药理作用。

随着植物靶mRNA表达调控、small RNA差异表达及miRNAs等研究的进展，对白花蛇舌草抗感染、抗肿瘤的研究已从传统的药用活性成分［5］、药理机制等层面，向微观调控表达方面转化。制备质量高、完整性佳的RNA是进行RT-PCR、small RNA测序、靶基因预测等分子生物学研究的首要条件。蛇舌草富含多糖［6］及次生代谢产物，RNA的分离纯化易受干扰，从而影响RNA提取的质量和产量。本研究以蛇舌草根、叶片为材料，分别选用Trizol法、多糖多酚总RNA提取试剂盒（RNA prep Pure Plant Kit）、植物总 RNA提取试剂盒、改良 CTAB法、RNAiso Plus法提取蛇舌草根和叶组织RNA，再经琼脂糖凝胶电泳、Aligent 2100及TGem微量分光光度计检测，以选择适合白花蛇舌草组织总RNA的提取方法。

1　材料与仪器

1.1药材

样品于2015年9月采集于广东药科大学药用植物园，由中药学院刘基柱副教授鉴定为茜草科耳草属植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的全草。

将整株白花蛇舌草用纯化水洗净，置70%（体积分数，下同）乙醇中消毒1 min，灭菌水冲洗干净，消毒纱布擦干水分，用刀将根部切成小段，放入冻存管经液氮速冻，于-80℃保存。叶片进行同样的处理并保存。每次选取所需部位约100 mg备用。

1.2试剂

RNAiso Plus试剂（TaKaRa生物公司）；RNA prep Pure Plant Kit（北京天根生物公司）；植物总RNA提取试剂盒（北京天根生物公司）；CTAB（深圳基迪奥生物公司）；β-巯基乙醇（广州鼎国生物公司）；酚仿试剂（广州鼎国生物公司）；三氯甲烷、异戊醇等生化试剂及琼脂糖凝胶电泳试剂均购自上海生工生物公司。

1.3仪器

3-30K型号超低温离心机（德国Sigma）；Gene Genius型全自动凝胶成像及分析系统（美国Syngene公司）；BG-SUBMIDI型电泳槽（百晶仪器厂）；Aligent 2100（美国安捷伦公司）；TGem微量分光光度计（北京天根生物公司）。

2　方法

2.1总RNA提取

2.1.1改良 CTAB法［7］研钵用液氮预冷，从-80℃冰箱取蛇舌草根、叶各约100 mg，加液氮迅速研磨成粉。将粉末转移至1.5 mL RNase free离心管中，加入CTAB 600 μL（临用时加入质量分数1% β-巯基乙醇12 μL），混匀，65℃水浴20 min（期间振摇几次）。加入等体积三氯甲烷-异戊醇（体积比24 ∶1），混匀，4℃、12 000 r/min离心10 min。吸取上清液，加等体积的酚仿试剂（苯酚-三氯甲烷，体积比25 ∶24）混匀，4℃、12 000 r/min离心10 min。吸取上层水相，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇（体积比24∶1）混匀，4℃、12 000 r/min离心10 min。取上清液，加入等体积异丙醇，于-20℃沉淀1 h，4℃、12 000 r/min离心10 min。弃上清，加75%乙醇（DEPC水配制）1 mL，洗涤沉淀，重复1次，4℃、12 000 r/min离心5 min。弃上清，4℃、8 500 r/min离心15 s，尽可能吸干乙醇，真空干燥2～4 min。加入DEPC水20～50 μL，室温溶解，-80℃保存。

2.1.2Trizol法［8］研钵用液氮预冷，从-80℃冰箱取蛇舌草的根、叶各约100 mg，加液氮迅速研磨成粉，将粉末转移至装有1 mL Trizol Reagent的RNase free离心管中，混匀，冰上静置5 min。加200 μL三氯甲烷（Trizol试剂的1/5），剧烈振荡至溶液呈乳白色，冰上放置3 min，4℃、12 000 r/min离心15 min。吸取上清液，加入等体积异丙醇，混匀，冰上放置10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min。弃上清，加入75%乙醇（DEPC水配制）1 mL，洗涤RNA，4℃、12 000 r/min离心10 min。吸尽乙醇，倒置EP管，干燥RNA，加入DEPC水20～40 μL使溶解，-80℃保存。

2.1.3RNAiso Plus法［9］研钵用液氮预冷，从-80℃冰箱取蛇舌草的根、叶各约100 mg，加液氮迅速研磨成粉，加适量的RNAiso Plus后匀浆，转移至1 mL RNase free离心管中，混匀，室温放置5 min，4℃、12 000 r/min离心5 min，将上清液转移至1.5 mL RNase free离心管，加1/5 RNAiso Plus的三氯甲烷，剧烈振荡至溶液呈现乳白色，室温静置3 min，4℃、12 000 r/min离心15 min。吸取上清液，加等体积的异丙醇，室温静置10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清。用等量的75%乙醇（DEPC水配制）洗涤RNA，4℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清。倒置EP管，干燥RNA，加入DEPC水20～40 μL使溶解，-80℃保存。

2.1.4RNA prep Pure Plant Kit试剂盒 RNA prep Pure Plant Kit试剂盒参照具体的说明书进行。

2.1.5植物总RNA提取试剂盒法 植物总RNA提取试剂盒参照相应的说明书进行。

2.2不同提取方法总RNA质量检测

2.2.1总RNA完整性检测 取总RNA样品3 μL，质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，150 V恒压15 min，利用凝胶成像系统观察RNA条带，并拍照记录。

2.2.2总RNA纯度检测 取总RNA样品8 μL，进行TGem微量分光光度检测，每次上样1.5 μL，平行测5次，记录总 RNA浓度、D（γ）260 nm/D（γ）280 nm、D（γ）260 nm/D（γ）230 nm，求平均值，并计算RSD值。

2.2.3Agilent 2100 Bioanalyzer检测 将RNA prep Pure Plant Kit试剂盒、CTAB法提取所得总RNA样品分离纯化后，Agilent 2100 Bioanalyzer上样检测总RNA质量完整性，并构建总RNA表达谱。

3　结果与分析

3.1琼脂糖凝胶电泳总RNA完整性检测

将不同提取方法所得RNA进行电泳检测，结果见图1。可见，RNA prep Pure Plant Kit提取总RNA 的28S、18S条带清晰稳定，此方法几乎消除了DNA、蛋白质的污染，说明此种方法所得蛇舌草根、叶片总RNA的质量、完整性较佳。植物总RNA提取试剂盒提取得到的RNA条带虽然稳定，但2条主条带亮度几乎相等，说明RNA存在部分降解，且产率低于RNA prep Pure Plant Kit。改良CTAB法提取蛇舌草根、叶片总RNA的28S、18S条带虽完整，可见叶片组织RNA 28S条带亮度约18S的2倍；但点样孔与28S之间出现明亮条带，说明RNA受杂质污染；且出现拖尾现象，说明 RNA存在降解。RNAiso Plus法及Trizol试剂提取RNA结果不理想。

图1　5种方法提取的蛇舌草根和叶片总RNA琼脂糖凝胶电泳结果Figure 1 The results of five total RNA extraction methods by agarose gel electrophoresis（AGE）

3.2总RNA纯度检测

据文献［10］报道，当D（γ）260 nm/D（γ）280 nm比值在1.8～2.1，说明提取的RNA不受蛋白质或多糖杂质污染，纯度高、质量佳；当D（γ）260 nm/D（γ）230 nm比值低于或高于2.0～2.3，说明RNA可能受降解、蛋白质的干扰。

将上述不同方法提取到的蛇舌草根和叶总RNA在TGem微量分光光度计上检测，RNA纯度检测结果见表1。可见，RNA prep Pure Plant Kit试剂盒提取的根、叶片总 RNA的 D（γ）260 nm/D（γ）280 nm值分别为1.928、2.019，处于1.8～2.1范围内，说明无蛋白质或多糖污染，D（γ）260 nm/D（γ）230 nm值分别为1.94、1.937，接近2.0，说明提取的RNA纯度较高、无降解。虽然改良CTAB法提取的根、叶片总RNA的浓度和RNA prep Pure Plant Kit试剂盒相差无几，但前者的 D（γ）260 nm/D（γ）280 nm比值明显＜1.8，说明所得RNA中存在蛋白质或有机溶剂的污染。在叶片 RNA 中 D（γ）260 nm/D（γ）230 nm比值＞2.3，则RNA降解，这与琼脂糖凝胶电泳结果相符。

表1　5种方法提取的蛇舌草根、叶片总RNA检测结果Table 1 The production rate and quality of five total RNA extraction methods

为进一步比较分析RNA prep Pure Plant Kit试剂盒和改良CTAB法提取RNA的质量，筛选更适合蛇舌草总RNA提取的方法，将RNA prep Pure Plant Kit试剂盒和改良CTAB法提取得到的蛇舌草根、叶总RNA混合纯化，进行Agilent 2100质量检测，质检表达谱见图2。可见，RNA prep Pure Plant Kit试剂盒表达谱显示2条清晰完整的主峰，分别为28S和18S；改良CTAB提取RNA的表达谱可见多条不规则峰带，无特征性的主峰。其余检测结果数据见表2。可见，RNA prep Pure Plant Kit试剂盒所得RNA符合建库标准，而改良CTAB法所得RNA降解、含有杂质较多，不符合建库标准。

3.3Agilent 2100质检

Agilent 2100生物分析仪可以微小样品消耗量进行检测，最大限度地减少有害物质的接触，降低RNA酶污染。其采用的RIN值能够直观地反映总RNA降解程度，即使是微量的降解也很容易被检测出来，使结果标准化，是目前最好的RNA质量分析方法。

图2　RNA prep Pure Plant Kit试剂盒（A）和改良CTAB法（B）提取蛇舌草总RNA Agligent 2100检测结果Figure 2 The results of RNA prep Pure Plant Kit（A）and Improved CTAB method（B）　to the extraction of Hedyotis diffusa Willd total RNA by Aligent 2000

表2　RNA prep Pure Plant Kit试剂盒和改良CTAB法提取蛇舌草总RNA质量检测结果Table 2 The results of RNA prep Pure Plant Kit and improved CTAB method to the extraction of Hedyotis diffusa Willd RNA

4　讨论

Trizol法、CTAB法及改良的CTAB法、酚-SDS法、试剂盒法等都是最常见的RNA提取方法。陈美霞等［11］通过多种植物RNA提取方法的对比与优化，发现用热硼酸法能高效快速的提取到红麻福红992叶片总RNA。因为不同植物或者同一植物不同部位及不同品种往往存在属性差异，材料内组分含量及质量也有差异，在研究中无法用固定的方法来提取不同植物、不同组织的RNA，需结合材料特性，不断探索与优化，找到合适的提取方法。

蛇舌草成熟期很短，植物纤维、多糖等含量较高，生长过程中次生产物大量积累［5］。多糖的结构与RNA相似度高，对RNA的分离纯化有很大影响，在RNA沉淀过程中，多糖杂质易形成凝胶状沉淀，在DEPC溶解后这部分沉淀易形成多糖絮状物，可造成RNA产率降低，因此，能否将这些杂质去除是提取高质量RNA的关键［12］。蛋白质污染也是影响RNA质量的主要因素之一［13］，试验中在蛋白质沉淀环节上清液能够少吸尽量不要多吸。

RNase是另一个影响RNA质量的主要物质，本身性质非常稳定，分布广泛，对RNA有水解作用，但对DNA不起作用，这给试验增添了难度［14］。在研磨破碎成粉的过程中，除内源RNase会造成RNA的降解外［15］，操作者汗液及唾液、空气灰尘、各种试验器皿中均可能存在RNA酶。为减少RNase酶污染，首先，试验所用离心管须无菌无酶，所用耗材、试剂等做灭RNase处理，即DEPC水浸泡过夜或高压灭菌等；其次，RNA提取最好在无菌超净台进行，且操作者须全程戴口罩、勤换手套。

本文结果显示，RNA prep Pure Plant Kit试剂盒对白花蛇舌草的植物细胞壁具有较强的裂解能力，试剂盒中DNAse I干粉可有效地消除基因组污染，稳定性好，无异丙醇及乙醇洗涤过程，RNA可以直接从离心柱上洗脱，避免了其他方法干燥不易溶解的问题，因此RNA产率相对较高。本方法可基本上排除多糖、蛋白质及DNA的干扰，经琼脂糖凝胶电泳及Aligent 2100生物分析仪检测分析，提取的总RNA质量和纯度均可满足后续small RNA测序、靶mRNA预测、转录组测序等分子生物学实验要求。

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（责任编辑：陈翔）

本刊将更名为《广东药科大学学报》

广东药学院已更名为广东药科大学，本刊也将随之更名。但期刊更名需上报国家新闻出版广电总局审批，批准后才能启用新刊名。现更名事项正在申办中，因此，目前本刊仍用《广东药学院学报》刊名出版，但本校论文的作者单位改为“广东药科大学”。

（本刊编辑部）

Comparison and optimization of the total RNA extraction method from Hedyotis diffusa Willd

CHEN Yanlin，WANG Yingfang
（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the best extraction method of total RNA in Hedyotis diffusa Willd.Methods Taking roots and leaves of Guangdong-grown Hedyotis diffusa Willd.as materials，Trizol method，RNA prep Pure Plant Kit，Plant Total RNA extraction kit，Improved CTAB method and RNAiso Plus Reagent method were used to extract total RNA，and the integrity，purity and yield of five total RNA extraction methods were compared by agarose gel electrophoresis（AGE）and Aligent 2100.Results RNA prep Pure Plant Kit and Plant Total RNA extraction kit could extract the integral and high-quality total RNA.According the 1.5% agarose gel electrophoresis（AGE）experiment，both the 28S and 18S bands were clear，and the former was brighter than the latter.D（γ）260 nm/D（γ）280 nmand D（γ）260 nm/D（γ）230 nmwere all in 2.0 above，and the leaves production rate was the highest and up to 390.35 g/L.The result of Aligent 2100 showed that the 28S band was twice the brightness as the 18S.Although the improved CTAB method could effectively suppress the influence of polysaccharides and polyphenols，the genome were polluted seriously.Both RNAiso Plus reagent method and Trizol were useless for the extraction of total RNA.Conclusion The difference lies in different species of plants or different varieties of one species，and it even occurs indifferent parts of the same plant，so the RNA extraction method must be selected appropriately according to the characteristics of plants.RNA prep Pure Plant Kit has been proved to be able to extract good-quality RNA from the roots and leaves of Hedyotis diffusa Willd.tissue，which can meet the requirements of subsequent experiment.

Hedyotis diffusa Willd；Total RNA；extraction

R282.2

A

1006-8783（2016）04-0410-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032402

2016-03-24

国家自然科学基金青年基金项目（81403195）；广东省自然科学基金项目（S2013010015418）

陈艳琳（1991—），女，2014级硕士研究生，Email:944589543@qq.com；通信作者:王颖芳（1975—），女，副教授，从事中药方剂学研究，Email:150306757@qq.com。

网络出版时间:2016-07-08 17:09 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160708.1709.005.html