苍耳子水提取物UPLC和HPLC特征图谱的比较研究

周海玲，马麟，许舜军，杨柳，，黄珍霞（.广东省中医院，广东广州500；.广州万正药业有限公司，广东广州50663）

苍耳子水提取物UPLC和HPLC特征图谱的比较研究

周海玲1，马麟1，许舜军2，杨柳1，2，黄珍霞1
（1.广东省中医院，广东广州510120；2.广州万正药业有限公司，广东广州510663）

目的通过建立并比较苍耳子水提物的超高效液相色谱（UPLC）和常规高效液相色谱（HPLC）的特征化学图谱，筛选苍耳子药材品质控制的优化方案。方法分别建立苍耳子药材水提物的UPLC和HPLC特征化学图谱分析方法，比较2种方法的分离能力、分离效率以及检测灵敏度等。UPLC检测色谱条件如下:色谱柱为Agilent SB-C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温为35℃；流动相A为甲醇，B为0.1%（体积分数，下同）H3PO4（pH=2.3），梯度洗脱；流速为0.4 mL/min；检测波长为220 nm。HPLC检测采用Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为35℃；流动相A为甲醇，B为0.1%（体积分数）H3PO4（pH=2.3），梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测波长为220 nm。结果 分别建立了27批不同产地苍耳子药材的UPLC和HPLC特征图谱，共检测到16个共有色谱峰，指认了其中10个色谱峰的化学归属。结果表明，UPLC法可大大缩短苍耳子药材水提取物的分析时间，且检测灵敏度也有显著提高，说明UPLC法在分离能力和分离效率方面明显优于HPLC法。结论与HPLC法相比，UPLC法既达到了分析的高通量，得到更高的分析灵敏度；又大大提高了分析速度，减少了有机溶剂的消耗。UPLC法测定中药材苍耳子水提取物的特征图谱可为其质量控制提供更为高效快速的检测方法。

UPLC法；HPLC法；苍耳子水提物；特征化学图谱

苍耳子为菊科植物苍耳（Xanthium sibiricum Patr.）干燥成熟带总苞的果实，中医临床上主要用于风寒头痛、鼻渊流涕、风疹瘙痒、湿痹拘挛等症的治疗，为历代治疗鼻渊及头痛的要药［1-2］。苍耳子含有大量的有机酸类化合物［3-5］，这类化合物被证实具有良好的抗氧化、抗感染、抗微生物、抑制酶活性、保护肝细胞、抑制血小板凝集等生物活性［6］，是苍耳子发挥临床疗效的重要药效组分。超高效液相色谱法（UPLC法）是分离科学中的一个新类别，相对于传统HPLC法而言，UPLC法在柱效、分析通量、灵敏度及色谱峰容量等方面均有显著提高［7-8］，弥补了传统HPLC系统的不足，为中药等复杂体系的分离分析提供了良好的技术平台［9］。本文以中药苍耳子为研究对象，在前期UPLC和HPLC指纹图谱研究的基础上［10-11］，建立并比较了苍耳子水提物的UPLC及HPLC特征图谱，同时对其主要共有色谱峰的化学归属进行了指认。

1　仪器、材料及试剂

2695型高效液相色谱仪（配有自动进样器、在线脱气机、Waters 2998型PDA检测器、Empower 2色谱工作站，美国Waters公司）。Acquity UPLC超高效液相色谱系统（配有二元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、柱温箱、紫外检测器和Empower 2色谱工作站，美国Waters公司）；AB 135-S型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

苍耳子药材购自全国各大药材集散地，产地主要为江西、广西、陕西等地［11］，经广东省中医院副主任中药师冯倩茹鉴定为药典正品苍耳子X.sibiricum，详细信息见表1。

对照品原儿茶酸（批号:809-200102，供质量分数测定用）购自中国药品生物制品检定所；对照品新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸（批号均为090619，质量分数按HPLC面积归一化法测定均≥98%）购自成都普瑞法科技开发有限公司；噻嗪双酮苷（质量分数按HPLC面积归一化法测定均≥98%）由本实验室制备所得。甲醇为色谱纯，购自美国Fisher公司；其他化学试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂；超纯水经Milli-Q系统纯化制备［10］。

表1　27批苍耳子药材的来源信息表Table 1 A summary of 27 batches of Fructus Xanthii samples

2　方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1UPLC测定的色谱条件

色谱柱:Agilent SB-C18柱（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）；流动相:A为甲醇，B为 0.1%H3PO4（pH= 2.3），梯度洗脱条件:0～2 min，3%A→5%A；2～10 min，5%A→17%A；10～11 min，17%A→20%A；11～14 min，20%A→28%A；14～17 min，28%A→30%A；17～20 min，30%A→35%A；流速:0.4 mL/min；进样量:5 μL；柱温:35℃；检测波长220 nm。

2.1.2HPLC测定的色谱条件

色谱柱:Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相:A为甲醇，B为0.1%H3PO4（pH=2.3），梯度洗脱条件:0～5 min，0%A；5～15 min，0%A→10%A；15～20 min，10%A→14%A；20～25 min，14%A→15%A；25～30 min，15%A→19%A；30 ～35 min，19%A→25%A；35～45 min，25%A→35%A；45～70 min，35%A→45%A；流速:1.0 mL/min；进样量:10 μL；柱温:35℃；检测波长:220 nm。

2.2混合对照品溶液的制备

分别取对照品原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、苍耳子噻嗪双酮苷、1，3-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸5 mg，精密称定，置5 mL量瓶中，以20%（体积分数，下同）乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品储备液。分别取上述对照品储备液适量，置于同一10 mL棕色容量瓶中，加20%乙腈稀释至刻度，得混合对照品溶液。

2.3苍耳子供试品溶液的制备

取苍耳子药材粉末（过4号筛）约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水回流提取3次（20、20、10 mL），每次45 min，滤过，合并滤液至50 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。

2.4苍耳子特征图谱测定的方法学考察［11］

分别精密吸取混合对照品溶液5份，按照“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录各成分的保留时间和峰面积，其保留时间和峰面积的RSD值介于0.2%～1.1%；取苍耳子药材适量，按照“2.3”项下方法平行制备供试品溶液5份，按“2.1”项下色谱条件连续测定5次，记录各特征成分的保留时间和峰面积，其保留时间和峰面积的相对标准偏差分别低于0.9%和3.6%；同一批供试品溶液在不同时间点（0、2、4、8、24、48 h）的稳定性测试结果显示，其保留时间和峰面积的相对标准偏差不高于0.6%和2.8%，上述结果表明本特征图谱测定方法可行。

2.5苍耳子水提物特征图谱的测定

2.5.1色谱峰的指认

分别精密吸取混合对照品、各供试品溶液10 μL，按“2.1”项下条件测定，记录流出曲线。根据已知对照品、化合物的分子离子峰信息，结合紫外光谱、色谱保留时间等信息共进行了10个色谱峰的化学归属［7，11］，峰2、5、7、8、9、10、11、13、14、16分别为原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、苍耳子噻嗪双酮苷、1，3-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸。UPLC法、HPLC法测定所得的对照品溶液、27批苍耳子水提物特征图谱的共有模式图谱见图1。

图1　HPLC法与UPLC法测定的混合对照品溶液图谱及27批苍耳子水提物特征图谱的共有模式Figure 1 The chromatograms of mixed reference substances and common patterns of 27 samples of Fructus Xanthii water extract by HPLC and UPLC

2.5.2 苍耳子水提取物的HPLC和UPLC特征图谱比较

本试验首次建立了苍耳子水提物的UPLC特征图谱，并与HPLC特征化学图谱进行比较和分析。研究中UPLC与HPLC法采用的流动相系统相同，均为甲醇-0.1%H3PO4，色谱柱均为ODS C18柱。比较2种方法仪器所记录的色谱图，可以非常直观地看出，其色谱面貌比较一致，峰2、3、4、5、6、9、10、11、13、14、16在2张色谱图中均可一一对应，但在二者前半段的运行时间里，各色谱峰的出峰顺序存在差异，这可能是由于UPLC色谱柱的尺寸及填料的改变，特别是硅胶基质中键合了桥式乙烷基，引起色谱行为发生改变。

通过2种测定条件分析比较可知:HPLC方法转换并优化为UPLC方法后，苍耳子水提取物的分离时间由原来的70 min缩短至20 min，样品检测时间缩短至约原来的1/3；进样量减少了1/2，溶剂用量降低到约原来的1/9，且UPLC法所得响应值高于HPLC，在基本保持分离度的同时大大缩短了分析时间，减少了有机溶剂的用量，降低了分析成本。见表2。

3　讨论与结论

中药的质量控制是保证中药的安全、有效、质量稳定可靠的必要条件。苍耳子为常用中药，是历代治疗鼻渊及头痛的要药，其化学成分及药理活性的研究已有较多文献报道，但药材标准却还局限于来源、性状和理化鉴别，无更多的质量控制项目［2］，因此，迫切需要建立一种快速、简便且能准确反映其真伪优劣的质量评价方法。

表2　苍耳子水提物HPLC与UPLC分析条件的比较Table 2 　Comparison of HPLC and UPLC analysis conditions

本研究首次建立了苍耳子水取物的UPLC和HPLC化学特征图谱，通过对二者的分析比较得知，2种方法均有较好的整体分离度，其色谱面貌比较一致，可结合苍耳子有效成分的质量分数测定判别苍耳子药材的真伪优劣。HPLC法需花费70 min的分析时间，而UPLC法可在20 min内完成整个分析过程，可改善传统HPLC法在分析时所遇到的耗时、耗能等技术问题，且具有更高的分辨率与灵敏度、更少的进样量和溶剂消耗量，应用到苍耳子药材的鉴定与质量评价中具有明显优势。建立的苍耳子提取物的2种特征化学图谱均共有16个共有峰，对其中10个共有峰进行了化学归属的确认，可以显著增强质量控制的准确性和专属性，为苍耳子药材的质量评价提供了一定的借鉴作用。

［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，1997:1071-1072.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2015:162-163.

［3］韩婷，李慧梁，胡园，等.苍耳子中酚酸类化合物及不同品种和居群苍耳子中总酚酸含量的测定［J］.中西医结合学报，2006，4（2）:194-198.

［4］程智，王伦，陈斌，等.苍耳子的化学成分［J］.应用与环境生物学报，2011，17（3）:350-352.

［5］邱玉玲，代英辉，王东，等.苍耳子的化学成分［J］.中国药物化学杂志，2010，20（3）:214-216，225.

［6］赵昱，赵军，李湘萍，等.咖啡酰奎尼酸类化合物研究进展［J］.中国中药杂志，2006，31（11）:869-874.

［7］杨柳，吴金雄，许舜军，等.苍耳子中酚酸类化合物的鉴别及绿原酸的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（19）:85-88.

［8］明乾良，高翔，张宏，等.用HPLC法测定不同地区三种苍耳子中绿原酸的含量［J］.药学服务与研究，2008，8 （4）:258-260.

［9］MARY J WIGHT.Mass transport in sub-2-microm highperformance liquid chromatography［J］.J Chrom A，2007，11（48）:128-130.

［10］杨柳，苏芝军，许舜军，等.UPLC法同时测定苍耳子中4种酚酸类成分的含量［J］.药学学报，2010，45（12）: 1537-1540.

［11］YANG Liu，SU Zhijun，ZENG Xing，et al.Quality assessment of sructus xanthii based on fingerprinting using high-performance liquid chromatography［J］.J AOAC Inter，2015，95（4）:1053-1058.

（责任编辑：刘晓涵）

Comparison on characteristic chromatograms of water extract of Fructus Xanthii with UPLC and HPLC

ZHOU Hailing1，MA Lin1，XU Shunjun2，YANG Liu1，2，HUANG Zhenxia1
（1.Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China；2.Guangzhou ImVin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China）

Objective To establish a more feasible quality control method for Fructus Xanthii water extract by comparing the characteristic chromatograms obtained with ultra performance liquid chromatography （UPLC）and conventional HPLC.Methods UPLC and HPLC characteristic chromatogram of water extract of Fructus Xanthii were established respectively，and then their chromatographic behaviors were compared such as their peak capacity，resolution and sensitivity，and so on.UPLC separation was carried out on an waters symmetry C18column（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）with the mobile phase consisting of methanol and water containing 0.1%phosphoric acid（pH=2.3）at a flow rate of 0.4 mL/min，and the detective wavelength was at 220 nm and the column temperature was at 35℃.HPLC separation was performed on a waters symmetry C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phase was consisted of methanol and water containing 0.1%phosphoric acid（pH=2.3）with a flow rate of 1.0 mL/min，and the detective wavelength was set at 220 nm and column temperature was at 35℃.Results The established characteristicchromatogram of Fructus Xanthii had 16 characteristic common peaks，of which 10 constituents were identified by comparison with the chromatographic behaviors and UV spectra of reference substances. Compared with HPLC fingerprint，the UPLC fingerprint showed obvious advantages in peak shape，sensitivity，and separation time.Conclusion In consideration of the mentioned advantages along with higher analytical sensitivity，less injection volume and solvent consumption，UPLC characteristic chromatogram might be proposed for the quality evaluation method of Fructus Xanthii.

UPLC；HPLC；Fructus Xanthii water extract；chemical fingerprint

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0454-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016050602

2016-05-06

周海玲（1981—），女，中药师，从事医院药学研究；通信作者:杨柳（1974—），女，研究员，硕士研究生导师，从事中药活性成分与质量评价研究，Email:yangliu979@hotmail.com。

网络出版时间:2016-07-011 10:27 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1027.002.html