姬松茸发酵条件的优化及其动力学分析

曹新志,赵迎庆,游见明,刘　佳,任林生

(1.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;2.山东省临沂思科生物科技有限公司,山东临沂 276000)



姬松茸发酵条件的优化及其动力学分析

曹新志1,赵迎庆2,游见明1,刘佳1,任林生1

(1.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;2.山东省临沂思科生物科技有限公司,山东临沂 276000)

在摇瓶条件优化的基础上对姬松茸分批发酵动力学进行了3 L发酵罐分配发酵研究,基于Logistic和LuedekingPiret方程描述姬松茸菌体生长、胞外多糖、底物消耗的代谢规律。结果表明最适培养条件为转速152 r/min、通气0.58 m3/h、接种量6%、温度24.6 ℃、pH6.4。在此条件下，胞外多糖含量6.955 g/L，菌体干重1.420 g/100 mL。菌体生长和胞内活性多糖生成是同步的,得到描述分批发酵过程的动力学数学模型和模型参数,同时对实验数据与模型参数进行了验证比较,模型计算与实验结果较好拟合。产活性多糖属于偶联型以及模型可用于预测发酵过程。

姬松茸,液体发酵,胞外多糖,动力学分析

姬松茸(AgaricusblazeiMurill)又称“巴西蘑菇”、“小松菇”、“柏氏蘑菇”,在分类学上隶属于真菌门(Aumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes),伞菌目(Agaricales),蘑菇科(Agaricaceae),蘑菇属(Agaricus)[1],是1种珍稀的食药兼用真菌[2]。在巴西圣保罗市周边的草原、秘鲁、美国加利福尼亚州、福罗里达州都有自然生长的姬松茸。1945年首次被美国真菌学家A.Murrill发现。1967年比利时的海涅曼博士鉴定其为新种与双孢菇同属[3]。随后,姬松茸传到日本。1992年我国福建省从日本引进了姬松茸并进行栽培。此后才由福建传到其他各个省份[4]。由于栽培姬松茸的温度、湿度等条件比较苛刻,所以我国北方很少栽培姬松茸。

在以往对姬松茸液体发酵的研究中,大都停留在摇瓶发酵阶段,但是要实现其大规模发酵生产就必须经历发酵罐的放大实验,所以从摇瓶到发酵罐的放大是发酵产品开发过程中的一个重要环节。但与摇瓶发酵相比发酵罐的发酵温度、pH、罐压、溶氧、转速等发酵参数更容易检测和控制,二者的区别主要体现在发酵罐可以对各项指标实时监控,同时两者在供氧能力和剪切力上也有较大的差别。本研究在摇瓶发酵工艺的基础上进行了3 L发酵罐的发酵条件优化,期望为进一步工艺放大提供依据。

同时本文还研究了姬松茸的菌体生长动力学和基质消耗动力学以及胞外多糖产生动力学,应用动力学模型可以预测菌丝体的生长状态,可以更为方便的通过动力学模型实现对发酵过程的优化控制,同时这也为姬松茸液体发酵进一步放大培养奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

姬松茸菌种(AgaricusBlazeiMurill)华中农业大学菌种保藏中心提供;工业玉米浆天津利发隆化工科技有限公司;蔗糖、麦粒自贡农贸市场;液体母种发酵培养基马铃薯200 g,麸皮10 g,蔗糖20 g,KH2PO42 g,MgSO4.5H2O 0.2 g,蒸馏水1000 mL,pH自然;液体发酵培养基[5]蔗糖57.5 g/L,工业玉米浆2.05 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO4.5H2O 0.2 g/L,VB10.01 g/L,蒸馏水1000 mL,pH自然;麦粒培养基煮熟的麦粒200 g,蔗糖10 g,KH2PO42 g,MgSO4.5H2O 0.2 g,碳酸钙10 g,pH自然。

Biotech-3BGH 3 L发酵罐上海保兴生物设备工程有限公司。

1.2实验方法

1.2.1Plackett-Burman设计Plackett-Burman设计法是一种两水平实验设计方法,该法实验次数少同时可以将众多的考察因素的影响效应作主次排序,因此该方法被广泛的应用到生物工艺过程优化中[6]。

根据前期实验以及食用菌发酵罐发酵的规律,实验选取的因素及编码水平见表1,以菌体干重、胞外多糖含量为评价指标,利用design-expert 8.0软件进行Plackett-Burman实验设计。

表1　Plackett-Burman实验设计因素水平及编码表Table 1　The factor and coding of the Plackett-Burman

1.2.2中心复合实验响应面分析法(Response Surface Analysis)是一种从多因素系统中寻求最佳条件的数理统计方法[7],最常用的是二次回归旋转中心组合实验设计(Central Composite Design)和中心复合实验设计(Box-Behnken)[8]。利用design-expert 8.0软件对实验数据进行二次回归拟合得二次回归方程,通过响应面分析,分析模型显著性、各因素的主效应和交互效应,进而寻求最优影响因子的水平,最终得到最适液体发酵条件。

对于二因子数学模型可表述为:

Y=a0+a1x1+a2x2+a12x1x2+a11x12+a22x22

式(1)

上式中,Y为响应值即姬松茸胞外多糖含量,a0为截距,a1、a2、a11、a22均为回归模型的系数。

根据Plackett-Burman实验设计结果进行Box-Behnken实验设计,以温度、转速、通气、pH为自变量,接种量控制在8%,分别用A、B、C、D表示,并用-1、0、1代表编码水平,以胞外多糖含量Y作为响应值,实验因素水平见表2。

表2　实验因素水平Table 2　The factor of the Box-Behnken

1.2.3动力学模型的建立在分批发酵过程中,发酵模型往往是根据微生物生长、菌体代谢以底物消耗之间关联建立的,然后通过实践不断的去验证模型的准确性,这样才能更好的去控制发酵过程。在本章节的研究中主要按菌体生长、底物消耗、胞外多糖的积累三者之间的关系来对姬松茸液体发酵动力学模型进行研究。

1.2.4姬松茸菌体生长动力学模型目前对微生物菌体生长动力学模型应用广泛的是Monod方程[9],Monod方程为典型的非结构模型,该模型着眼于整个微生物群体的变化,不考虑个体细胞水平的变化,但相关表明研究Monod方程仅适用于细胞群体生长缓慢且细胞密度较低的发酵环境[10],发酵过程中不应存在高浓度底物抑制、代谢物反馈抑制、营养物不足等导致的菌体生长缓慢现象。通过实验发现当发酵液中蔗糖浓度小于4.5 g/L时菌体生长速率明显下降并伴有溶菌现象,这说明发酵液中的限制性底物对菌体生长的限制性不能忽略,因此Monod方程不能做用作姬松茸菌体生长动力学模型。

分批发酵生长环境固定,所以在培养基各营养成分固定情况下,从姬松茸发酵代谢分析可知,菌体生长会有一个最大值点,根据以上假设姬松茸菌体生长曲线应为S型,这与种群生长规律类似,在研究限制空间种群增长规律时应用广泛的则为Logistic方程。Logistic方程是典型的S型曲线[11],这说明Logistic方程可以很好地反映分批发酵过程中菌丝体生长规律。Logistic方程模型见公式(2)。

μ=dX/dt=μmax(1-X/Xmax)

式(2)

式(2)中X:菌丝体干重,单位g/100 mL;t:发酵时间,单位h;μ:比生长速率;μmax代表最大细胞比生长速率;Xmax代表最大菌体浓度,单位g/100 mL。将(2)式积分得:

X(t)=(X0eμmaxt)/[1-X0/Xmax(1-eμmaxt)]

式(3)

表3　Plackett-Burman实验设计及响应值Table 3　Plackett-Burman experimental design and results

式(3)中X0代表初始菌体浓度,单位g/100 mL。

在发酵刚开始时,X值比Xmax要小很多,所以此时(X0/Xmax)接近于0可以忽略不计,说明菌体呈现指数生长,但当X值比Xmax相当的时候,这时说明菌体生长缓慢或者菌体停止生长。在对姬松茸进行分批发酵实验中,发现Logistic方程具有很好的适应性。

1.2.5姬松茸胞外多糖生成动力学模型胞外多糖是姬松茸发酵过程中分泌到细胞外的产物,根据摇瓶实验和发酵罐结果可知,胞外多糖在发酵初期有少量合成,当发酵进入平稳期后胞外多糖开始大量合成,因此可以将姬松茸胞外多糖合成类型归于部分相关型。目前对于此类型产物合成的动力学模型广泛采用Luedeking-Piert模型[12-14]:

dp/dt=α(dx/dt)+βX(a≠0,β≠0)

式(4)

式(4)中α为生长相关系数,β为非生长相关系数,dP/dt为胞外多糖生成速度,P为胞外多糖浓度g/L。

当t=0,P=P0时,将式(2)代如式(4)得:

dp/dt=αμmax(1-X/Xmax)+βX(a≠0,β≠0)

式(5)

对式(5)积分得:

P(t)=P0+α[X(t)-X0]+β(Xmax/μmax)ln[1-X0/Xmax(1-eμmaxt)]

式(6)

1.2.6底物消耗动力学模型根据发酵的摇瓶实验和发酵罐实验结果,姬松茸对蔗糖的利用呈现倒S形。培养中蔗糖主要有三个方面的用途:姬松茸菌体生长消耗；维持姬松茸正常各项生命活动消耗；合成胞外多糖消耗。因此姬松茸底物消耗动力学模型可以表示为:

-dS/dt=(1/YX/S)(dx/dt)+(1/YP/S)(dP/dt)+mX

式(7)

式(7)中YX/S代表姬松茸菌体得率系数,单位g/g;YP/S代表姬松茸胞外多糖得率系数,单位g/g;S为蔗糖浓度,单位g/L;m为姬松茸菌体维持系数。

将式(2)与式(4)带入式(7)中得:

-dS/dt=(1/YX/S)[μmax(1-X/Xmax)]+(1/YP/S)[αμmax(1-X/Xmax)+βX]+mX

式(8)

对式(8)积分得:

S(t)=S0-(1/YX/S+α/YP/S)[X(t)-X0]-(β/YP/S+m)(Xmax/μmax)ln[1-X0/Xmax(1-eμmaxt)]

式(9)

式(9)中S0代表当t=0时蔗糖初始浓度。

1.3测定方法

1.3.1残糖的测定DNS法测定还原糖[15],Roe比色法测定蔗糖[16]。

1.3.2生物量的测定参照周选围生物量测定方法[17]。

1.3.3总糖的测定苯酚-硫酸法[18]。

1.3.4溶氧(DO)消耗的测定发酵液溶氧采用溶氧电极进行测定。培养基灭菌结束循环水浴降温至发酵温度,向培养基通风搅拌至溶解氧达到饱和,此时溶氧电极读数定义为100.0。

1.3.5发酵液pH的测定采用pH电极进行测定测定。

1.3.6发酵设备及培养基的灭菌实验选用食用油作为消泡剂,灭菌前往发酵罐内滴加几滴食用油,然后用牛皮纸包住空气过滤器,尾气出口由里到外依次用棉花、纱布、牛皮纸包裹,灭菌前用夹子夹住与罐体相连的硅胶管,然后在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。

2　结果与讨论

2.1Plackett-Burman设计

2.2因素主次的确定

2.2.1以姬松茸菌体干重为响应值影响因素主次的确定利用design-expert 8.0软件以姬松茸菌体干重为响应值对实验结果进行分析,分析结果如下表4。

由表4中的“Prob>F值”可以对实验影响因素主次做出排序,因素主次顺序依次是A>B>E>C>D,即:温度>转速>通气>pH>接种量。由表4中的显著性检验(p<0.01),可以看出温度、转速、通气、pH,4个因素对姬松茸液体发酵有着极显著的影响。

表4　偏回归系数及显著性检验Table 4　Partial regression coefficients and their significance test

注:“**”表示影响极显著(p<0.01),表5同。

表5　偏回归系数及显著性检验Table 5　Partial regression coefficients and their significance test

2.2.2以姬松茸胞外多糖为响应值影响因素主次的确定利用design-expert 8.0软件以姬松茸胞外多糖为响应值对实验结果进行分析,分析结果如下表5。

由表5中的“Prob>F值”可以对实验影响因素主次做出排序,因素主次顺序依次是A>B>E>C>D,即:温度>转速>通气>pH>接种量。由表4中的显著性检验(p<0.01),可以看出温度、转速、通气、pH,4个因素对姬松茸液体发酵有着极显著的影响。

经过实验发现无论是以菌体干重还是以胞外多糖为响应值,温度、转速、通气、pH,4个因素都对实验有着极显著的影响。所以在接下来的研究实验中对温度、转速、通气、pH,4个影响因素进行进一步的实验。

2.3中心复合实验

表6　中心复合实验设计及结果Table 6　Design and results of Box-Behnken design

续表

实验顺序实验号X1X2X3X4菌体干重(g/100mL)胞外多糖(g/L)122700001.3406.73813230-1010.8736.597142600001.3796.77015500-1-11.1076.536161810-101.0075.513172800001.2956.865181401-101.2416.67719130-1-101.0836.44620700-111.1746.5532121-1000.8075.399222010101.0915.76323411000.8255.4302411-10011.0236.1342517-10-101.1356.0152610100-10.8535.536271601101.1446.778289-100-11.1716.257291210010.9655.638

表7　回归模型方差分析Table 7　Analysis of variance of regression model

注:“*”表示影响显著(0.01

2.4拟合模型的建立及显著性检验

在实验中发现姬松茸菌丝生物量和多糖含量变化存在不平行性,生物量的提高不一定使有效成分多糖含量提高,所以姬松茸发酵条件优化将以多糖产量是考虑的最终因素。

利用design-expert 8.0软件对实验结果进行分析,结果见表6。

数学模型经二次回归拟合,得以胞外多糖回归方程预测模型:

Y=-26.4268+1.1408X1+0.0409X2+2.956X3+3.0946X4-2.9167X1X2+0.03X1X3+0.0433X1X4-4.6667X2X3+5.4167X2X4-0.3975X3X4-0.0283X12-2.1694X22-0.3533X32-0.374X42

利用design-expert 8.0软件对二次回归模型进行分析,得到温度、转速、通气、pH,4个因素之间的立体分析图和等高线图。结合图1、图2及design-expert 8.0软件综合分析得到姬松茸液体发酵胞外多糖最大值点:温度24.6 ℃、转速152 r/min、通气0.58 m3/h、pH6.4,此时胞外多糖7.0179 g/L(预测值)，菌体干重达到1.472 g/100 mL(预测值)。

图1　温度和转速对胞外多糖响应面图Fig.1　Response surface for alternative effects of temperature and rotational speed on extracellular polysaccharide

图2　温度和pH对胞外多糖响应面图Fig.2　Response surface plots for alternative effects of temperature and pH on extracellular polysaccharide

实验优化出发酵温度24.6 ℃,考虑到发酵过程温度的波动性以及结合实验规律,最终确定姬松茸液态发酵温度范围24.6 ℃。为了证实上述优化条件的可靠性,所以对优化条件进行3次以上的验证性实验,结果表明当温度24.6 ℃、转速152 r/min、通气0.58 m3/h、pH6.4时,胞外多糖含量6.955 g/L,菌体干重1.420 g/100mL,同理论值相比,相对误差分别为3.66%和0.904%。因此实验得到的姬松茸3 L液体发酵条件具有一定的可靠性和真实性。

2.5姬松茸3 L发酵罐发酵曲线及其动力学分析

为了了解姬松茸液体发酵培养条件优化后对菌体干重和胞外多糖含量的影响,在发酵过程中每隔12 h进行取样,测定姬松茸发酵过程中菌体干重、胞外多糖、残糖含量的变化,并对姬松茸液体发酵曲线进行简单的分析。结果见图3～图8。

图3　姬松茸分批发酵动力学曲线Fig.3　The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril

2.5.1姬松茸菌体生长动力学在发酵刚开始时,X值比Xmax要小很多,所以此时X0/Xmax接近于0可以忽略不计,说明菌体呈现指数生长,但当X值比Xmax相当的时候,这时说明菌体生长缓慢或者菌体停止生长。在对姬松茸进行分批发酵实验中,发现Logistic方程具有很好的适应性[19]。

式(3)可以表述为ln[X/(Xmax-X)-t]的函数,即:

ln[X/(Xmax-X)]=μt-ln[(Xmax/X0)-1]

式(10)

通过实验数据X0=0.004 g/100 mL,Xmax=1.417 g/100mL,以ln[X/(Xmax-X)]对t作图可得μmax=0.0602 h-1,将模型参数带入式(3)得姬松茸菌体生长的动力学方程:

X(t)=0.004e0.0602t/1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)

利用origin 8.0软件对实验数据进行非线性拟合得姬松茸菌体生长动力学模型非线性拟合曲线,见图4。

图4　姬松茸菌体生长拟合曲线Fig.4　The fitted curve on the growth of mycelium of Agaricus Blazei Murill

拟合方程相关系数R2=0.9616(0.01

2.5.2姬松茸胞外多糖生成动力学当姬松茸菌体生长处于稳定期时,dX/dt=0,X=Xmax,所以此时Luedeking-Pirct方程dP/dt=βX,即:

β=(1/Xmax)(dP/dt)

式(11)

图5　姬松茸分批发酵动力学曲线Fig.5　The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril

由于μmax、X0、Xmax均为已知,通过origin 8.0软件可以计算出当具体生长趋于稳态时dP/dt=0.156,带入式(11),即可得出β=0.1101。

令a(t)=X(t)-X0,b(t)=Xmax/μmaxln[1-(X0/Xmax)(1-eμmaxt)],这时姬松茸胞外多糖动力学模型可以写成:

P(t)=P0+αa(t)+βb(t)

式(12)

当t=0时,根据实验数据可得P=P0=0.026,所以:

P(t)=0.026+αa(t)+βb(t)

式(13)

式(13)可以看做P(t)-a(t)的一次函数,对其作图,可得直线斜率α=1.118。将模型参数μmax、X0、Xmax、α、β带入方程(6)得姬松茸胞外多糖生成的动力学方程:

P(t)=0.026+1.118[X(t)-0.004]+0.1101(1.417/0.0602)ln[1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)]

利用origin 8.0软件对实验数据进行非线性拟合得姬松茸胞外多糖生成的动力学模型非线性拟合曲线,见图6。

图6　姬松茸胞外多糖生成拟合曲线Fig.6　The fitted curve on the extracellular polysaccharide of Agaricus Blazei Murill

拟合方程相关系数R2=0.9828(0.01

姬松茸基质消耗动力学

图7　姬松茸分批发酵动力学曲线Fig.7　The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril

令α1=1/YX/S+α/YP/S,b1=β/YP/S+m,此时式(9)可以表述为:

S(t)=S0-α1[X(t)-X0]-b1(Xmax/μmax)ln[1-(X0/Xmax)(1-eμmaxt)]

式(14)

按照2.5.2中求解α、β的方法即可得出a1、b1的数值,即:a1=3.82、b1=0.087。将模型参数μmax、X0、Xmax、a1、b1带入方程(14)得姬松茸基质消耗动力学方程:

S(t)=57.5-3.82[X(t)-0.004]-0.087(1.417/0.0602)ln[1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)]

利用origin 8.0软件对实验数据进行非线性拟合得姬松茸基质消耗的动力学模型非线性拟合曲线,见图8。

图8　姬松茸基质消耗拟合曲线Fig.8　The fitted curve on the substrate consumption of Agaricus Blazei Murill

拟合方程相关系数R2=0.9873(0.01

3　讨论

在实验中发现姬松茸菌丝生物量和多糖含量变化存在不平行性,生物量的提高不一定使有效成分多糖含量提高,所以姬松茸发酵条件优化将以多糖产量是考虑的最终因素。

本研究实在摇瓶发酵的基础上进行的3L发酵罐的放大实验,实验过程中不能进行全程自动化控制,人工抽样检测可能会对实验结果带来一定的影响,需要进一步的实验对其深入研究。

4　结论

在本章节的研究中确定了3 L发酵罐最适培养条件:温度24.6 ℃、转速152 r/min、通气0.58 m3/h、pH6.4、接种量6%。经验证实验,在此条件下菌体干重1.420 g/100mL,胞外多糖含量6.955 g/L,同理论值相比,相对误差分别为3.66%和0.904%。

实验还对姬松茸分批发酵中菌体干重、胞外多糖、残糖含量的变化进行动力学分析并建立数学模型,所得拟合方程如下:

姬松茸菌体生长动力学方程

X(t)=0.004e0.0602t/1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)

姬松茸胞外多糖生成动力学方程

P(t)=0.026+1.118[X(t)-0.004]+0.1101(1.417/0.0602)ln[1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)]

姬松茸基质消耗动力学方程

S(t)=57.5-3.82[X(t)-0.004]-0.087(1.417/0.0602)ln[1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)]

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Optimization of submerge fermentation conditions ofAgaricusBlazeiMuril and dynamics analysis

CAO Xin-zhi1,ZHAO Ying-qing2,YOU Jian-ming1,LIU Jia1,REN Lin-sheng1

(1.Department of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;2.Shandong Linyi Sike biological technology Co.,LTD,Linyi 276000,China)

The 3 L fermentation tank allocation fermentation research aboutAgaricusBlazeiMuril batch fermentation dynamics was conducted on the basis of shaking flask conditions optimization,the metabolic regulation ofAgaricusBlazeiMurill bacteria growth,extracellular polysaccharide,substrate consumption were described based on Logistic and Luedekingpiret equation. The results showed that the optimum culture conditions were the stirring rate of 152 r/min,ventilation quantity of 0.58 m3/h,inoculation amount of 6%,temperature of 24.6 ℃ and pH at 6.4. Under the optimized conditions,1.420 g/100 mL for dry weight of mycelium,6.955 g/L for the amount of exopolysaccharides were achieved. Bacteria growth and the activity of intracellular polysaccharide generated were synchronous,the dynamic mathematical model and model parameters of describing the batch fermentation process were obtained,at the same time,the validation comparition about experimental data and model parameters were conducted,the model calculation and the experimental results had a good fitting. The active polysaccharide was classified as coupling model and the model could be used to predict the fermentation process.

AgaricusblazeiMurill;submerged cultivation;exopolysaccharides;dynamic analysis

2014-09-02

曹新志(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail:caoxinzhi@163.com。

TS201.1

A

1002-0306(2016)03-0170-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.028