产凝乳酶解淀粉芽孢杆菌的诱变选育

关明玲,李学朋,杨　敏,张忠明,张卫兵,*,师希雄,*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃兰州 730070;3.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070)



产凝乳酶解淀粉芽孢杆菌的诱变选育

关明玲1,2,李学朋1,2,杨敏1,2,张忠明1,张卫兵1,2,*,师希雄1,*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃兰州 730070;3.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070)

为了获得高产凝乳酶菌株,以产凝乳酶解淀粉芽孢杆菌为出发菌株,采用紫外线和硫酸二乙酯进行诱变。诱变后筛选得了一个突变株L-6,凝乳活力为1419.7 SU/mL,比原始菌株提高了40.2%;水解活力降低了22.39%,凝乳活力与蛋白水解活力的比值为125.64,比出发菌株提高了81.32%。传代实验表明,该菌株具有良好的遗传稳定性。

解淀粉芽孢杆菌,凝乳酶,诱变

诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,促进其突变频率大幅度提高,然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合育种目的的突变株,以供生产实践或科学实验之用[1-3]。微生物常用的诱变方法包括化学诱变、物理诱变、生物诱变和复合诱变[4-8]。紫外诱变是最为常用的一种物理诱变,DNA分子的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后形成嘧啶二聚体,二聚体出现会引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡[9-11]。另外二聚体的形成,会妨碍双链的解开,因而影响DNA的复制和转录[12]。硫酸二乙酯是一种化学诱变剂,用其进行诱变的特点是快速、安全和高效[13-14]。硫酸二乙酯与紫外诱变结合后具有协同效应,可以使菌种的突变率显著增加,诱变效果更好,已成功地用于亚硝化单胞菌、产脂肪酶细菌豆豉溶栓酶产生菌的诱变[15-17]。

本实验室前期成功地利用紫外线和硫酸二乙酯对产凝乳酶地衣杆菌进行了诱变。另外对甘南牧区的产凝乳酶细菌进行筛选,得到一株产凝乳酶的解淀粉芽孢杆菌,其酶活远远高于地衣芽孢杆菌[18-19]。本研究以产凝乳酶解淀粉芽孢杆菌为出发菌株,进行紫外线和硫酸二乙酯复合处理,以期筛选凝乳活力较高而水解活力较低的菌株,为细菌凝乳酶的发酵生产奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

表2　紫外诱变的初筛结果Table 2　The result of primary screening by UV

干酪素甘肃华羚生物科技有限公司,食品级;脱脂奶粉完达山乳业股份有限公司,食品级;麸皮兰州市安宁区桃海市场。硫酸二乙酯,蛋白胨,牛肉膏兰州嘉特星化学试剂有限公司。

SW-CJ-2FD超净工作台苏州净化设备厂;HD-E806恒温振荡培养箱上海一恒科学仪器有限公司;H1850R冷冻高速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司。

酪蛋白培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、产酶培养基参考张卫兵等的方法[18]进行配制。

1.2实验方法

1.2.1菌悬液的制备将菌种在酪蛋白培养基上活化,然后接种于装有20 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中,于37 ℃、170 r/min的摇床上振荡培养15 h,吸取5 mL培养液加入装有45 mL生理盐水和玻璃珠的三角瓶中,在振荡器上振荡20 min,将菌体充分打散后得到菌悬液[18]。

1.2.2紫外线诱变处理参考张卫兵[18]等的方法进行紫外线诱变,照射时间分别设定为0、30、60、120、180 s,诱变后计算致死率和正突变率。

致死率(%)=处理前每毫升活菌数-处理后每毫升活菌数/处理前每毫升活菌数×100

1.2.3硫酸二乙酯诱变处理参考张卫兵等的方法进行硫酸二乙酯诱变[18],处理时间分别设定为0、40、50、60、70、80、90 min,诱变后计算致死率和正突变率。

1.2.4突变菌株的筛选参考张卫兵[18]等的方法进行突变菌株的筛选。将突变株活化后,接种于装液量为20 mL/50 mL的三角瓶中,然后将三角瓶固定于摇床上,37 ℃、140 r/min振荡培养48 h。培养完成后,将发酵液8000 r/min离心5 min,得到粗酶液,通过测定酶活筛选菌株。

1.2.5突变株的遗传稳定性将筛选出的菌株连续传代8次,通过测定酶活力确定菌株的遗传稳定性。

1.2.6酶活的测定凝乳酶活力的测定采用Arima法[18],蛋白水解活力的测定采用Folin酚试剂法[18]。

1.3数据处理

用SPSS19.0分析软件对实验数据进行计算和分析。

2　结果与分析

2.1紫外线诱变的结果

菌株经紫外线照射不同时间后,不同处理时间下致死率和正突变率结果见表1。

由表1可看出,菌株在紫外线处理时,随照射时间的增加,致死率逐渐增大。照射60 s时致死率达到79.5%;照射120 s时,菌体致死率达到95.3%;照射180 s时,菌体全部死亡。这一变化趋势与地衣芽孢杆菌的紫外诱变基本相同。紫外处理时,正突变率呈现先增大后减小的趋势,照射60 s时正突变率最高,可达13.36%。致死率和正突变率的变化趋势与前期实验中对地衣芽孢杆菌诱变时基本相同,但最高正变率略低[18]。综合考虑,在本实验中选择60 s作为紫外线诱变的最佳处理时间。

表1　紫外线对菌株的诱变效果Table 1　The effect of UV treatment on the strains

2.2紫外诱变的初筛和复筛结果

菌株诱变后,涂布于分离平板上培养,待长出菌落后测定凝乳圈直径和菌落直径,部分菌株的测定结果见表2。

由表2可以看出经过紫外诱变后,菌株的凝乳圈直径与菌落直径比增大的有Z-1、Z-3、Z-4、Z-6、Z-7、Z-10,其中菌株Z-1的增加幅度最大,达8.0%。

选择凝乳圈直径与菌落直径比增大的菌株,发酵后测定凝乳活力和蛋白水解力,结果见表3。

表3　紫外诱变的复筛结果Table 3　The result of secondary screening by UV

由表3可以看出,凝乳圈直径与菌落直径比增大的几株菌的凝乳活力均比出发菌株有所提高,其中Z-1凝乳活力提高最大,达到了23.2%。与出发菌株的水解活力相比,Z-1、Z-4、Z-7的水解活力都有所降低,其中Z-4水解活力降低最大,达到了23.9%,Z-1水解活力降低也较大,达到了23.3%。从凝乳活力与蛋白水解活力的比值来看,Z-3和Z-10菌株的酶活比值减小,其余菌株的酶活比值都有所提高,其中Z-1的增幅最大,比出发菌株提高了60.6%。

表5　硫酸二乙酯诱变菌株的初筛结果Table 5　The result of primary screening by diethyl sulfate

表7　突变株DES-6不同代次的凝乳酶活力(SU/mL)Table 7　Milk-clotting activity of mutant DES-6 for different generation(SU/mL)

2.3硫酸二乙酯对菌株的诱变效应

以Z-1为出发菌株,采用硫酸二乙酯诱变后,不同处理时间下致死率和正突变率的结果见表4。

表4　DES的诱变对菌株的影响Table 4　The effect of diethyl sulfate treatment on the strains

由表4可以看出,当处理时间从40 min增加到90 min时,菌体致死率逐渐增大,当处理70 min时菌体的致死率为78.65%,处理90 min时,菌体致死率接近90%。正突变率随着处理时间的延长先增大后减小,处理70 min时正突变率最高(16.59%)。致死率和正突变率的变化趋势与前期实验中对地衣芽孢杆菌诱变时基本相同,说明两株细菌对硫酸二乙酯的敏感度接近[18]。综合考虑,在本实验中选择60 min为硫酸二乙酯诱变的最佳处理时间。

2.4硫酸二乙酯诱变的初筛及复筛结果

菌株经硫酸二乙酯诱变后,涂布于分离平板上培养,待长出菌落后测定凝乳圈直径、菌落直径,部分菌株的测定结果见表5。

由表5可以看出,突变株L-1、L-3、L-4、L-8、L-9和L-10的凝乳圈直径与菌落直径比值减小,其余菌株凝乳圈直径与菌落直径比值都小幅度增大,L-6的增大幅度最大,比出发菌株增大2.01%。

将凝乳圈直径与菌落直径比增大的菌株发酵后测定凝乳活力和蛋白水解力,结果见表6。

从表6中的测定结果来看,凝乳圈直径与菌落直径比增大的几株菌的凝乳活力均比出发菌株有所提高,其中菌株L-2、L-6的凝乳活力比出发菌株增大较多,分别比原菌株提高了8.9%和13.9%;菌株的水解活力变化不大,其中L-7水解活力反而比出发菌株增大了9.9%;从凝乳活力与蛋白水解活力的比来看,4株菌的酶活比都有所提高,其中L-6的增幅最大,比出发菌株提高了13.11%。突变株L-6凝乳活力比原始菌株提高了40.2%,水解活力降低了22.39%,凝乳活力与蛋白水解活力的比值提高了81.32%。

表6　硫酸二乙酯诱变菌株的复筛结果Table 6　The result of secondary screening by diethyl sulfate

2.5突变株的遗传稳定性

将突变株L-6连续传代8次,测定每代菌株的凝乳活力,每个代次三个平行,测定结果分别见表7。

由表7可以看出,传代后菌株的酶活稳定在1417.2～1428.7 SU/mL范围内,说明不同传代次数菌株的凝乳酶活力差异不显著,因而突变株L-6具有稳定的遗传性。

3　结论

通过实验确定了解淀粉芽孢杆菌紫外线诱变最佳处理时间为60 s,硫酸二乙酯诱变的最佳处理时间为60 min。紫外诱变后,经筛选得到的突变株Z-1凝乳活力提高了23.2%,水解活力降低了23.3%,凝乳活力与蛋白水解活力的比值比出发菌株提高了60.6%。

以Z-1为出发菌株,进行硫酸二乙酯诱变后,筛选得到的突变株L-6凝乳活力比原始菌株提高了40.2%,水解活力降低了22.39%,凝乳活力与蛋白水解活力的比值提高了81.32%。其凝乳活力稳定在1417.2～1428.7 SU/mL,菌株的遗传性稳定性良好。

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Study on mutation breeding ofBacillusamyloliquefaciensproducing milk-clotting enzyme

GUAN Ming-ling1,2,LI Xue-peng1,2,YANG min2,3,ZHANG Zhong-ming1,ZHANG Wei-bing1,2,*,SHI Xi-xong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Gansu provincial functional dairy engineering laboratory,Lanzhou 730070,China;3.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

To obtain an industrial strain with high milk-clotting activity,Bacillusamyloliquefaciensproducing milk-clotting enzyme was mutagenized with ultraviolet and diethyl sulfate. On the basis of multiple mutation,mutant DES-6 was screened. The milk-clotting activity of L-6 reached 1419.7 SU/mL,which was 40.2% higher than that of the parent strain,while the proteolytic activity was reduced by 22.39%. The ratio of milk-clotting activity to proteolytic activity reached 125.64,which was 81.32% higher than that of the parent strain. The pass-generation test indicated that DES-6 had good genetic stability.

Bacillusamyloliquefaciens;milk-clotting enzyme;mutation

2015-04-09

关明玲(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：乳品加工，E-mail:270154787@qq.com。

张卫兵(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail:zhangwb@gsau.edu.cn。

师希雄(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工，E-mail:shixx@gsau.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31560442)；“十二五”农村领域国家科技计划项目(2011AA100903)；甘肃省农业科技创新项目(GNCX-2014-31)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0156-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.025