新疆野生樱桃李枝、叶不同萃取部位抗氧化活性研究

刘　伟,李紫薇,陈文强,朱　燕,欧阳艳

(伊犁师范学院 新疆维吾尔自治区普通高校天然产物化学与应用重点实验,新疆伊宁 835000)



新疆野生樱桃李枝、叶不同萃取部位抗氧化活性研究

刘伟,李紫薇,陈文强,朱燕,欧阳艳*

(伊犁师范学院 新疆维吾尔自治区普通高校天然产物化学与应用重点实验,新疆伊宁 835000)

采用系统溶剂萃取野生樱桃李枝、叶甲醇提取物,分别得到其石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相,采用分光光度法测定其总酚含量,并通过清除DPPH自由基能力、还原能力、总抗氧化能力等化学模型对各部位的抗氧化活性进行测定。结果表明,野生樱桃李枝、叶提取物抗氧化活性与其总酚含量呈正相关性,提示酚类化合物为影响其抗氧化活性的主要因素。在三种抗氧化模型下,枝、叶各萃取相均表现一定的抗氧化活性,且具有相似的抗氧化活性规律:乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相,说明乙酸乙酯和正丁醇可以有效地富集野生樱桃李枝、叶抗氧化成分,其中树枝乙酸乙酯相抗氧化活性著高于BHA。说明野生樱桃李枝、叶提取物具有作为天然抗氧化剂的开发价值。

野生樱桃李，抗氧化活性，总酚，高效液相色谱

野生樱桃李(PrunusdivaricataLdb.),俗称野酸梅,蔷薇科李属,落枝灌木或小乔木[1]。植株高1.5～8.0 m,多分枝,枝条细长,开展形,枝繁茂,深绿色[2],主要分布于中亚天山、高加索、小亚细亚及巴尔干半岛,在我国仅分布于新疆伊犁霍城县的大西沟和小西沟[3]。本地哈萨克牧民长期食用樱桃李果酱或将果实晒干泡茶饮用,被誉为“雪域珍果”[4],具有天然的保健功能和开发前景。大量研究表明,具有抗氧化活性的物质可以有效的降低心脑血管疾病、糖尿病、癌症等疾病的发生概率,并可以有效的延缓衰老[5-6]。国内学者对野生樱桃李的研究多集中在生态、栽培及果实营养成分等方面[7-8]。对其有效成分的提取与活性研究近年来才逐步开展,其中野生樱桃李果皮色素和果肉总酚提取物均表现出了较好的抗氧化活性[9-10],对于野生樱桃李枝、叶提取物抗氧化活性的研究鲜有报道。实验采用系统溶剂法分别萃取野生樱桃李枝、叶的甲醇提取物,得到相应的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取相,采用分光光度法测定各萃取相中总酚的含量,通过清除DPPH自由基能力、还原能力、总抗氧化能力等化学模型对各部位的抗氧化活性进行了评价,分析其总酚含量与抗氧化活性之间的相关性,并对活性较好的部位进行HPLC分析,为该植物的综合开发利用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

野生樱桃李枝、叶于新疆伊犁霍城县大西沟10月采摘,经伊犁师范学院资源与生态研究所赵玉副教授鉴定为蔷薇科野生樱桃李枝与叶,洗净后自然晾干、粉碎过60目筛备用。

1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)长城生物化学工程有限公司;VC、BHA、福林酚试剂Sigma公司;没食子酸中国药品生物制品检定所;山奈酚标准品分析标准品(≥98%,国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠、三氯化铝、三氯乙酸、氯化铁、浓硫酸、钼酸铵、磷酸钠等均为分析纯。

LC-20A高效液相色谱仪日本岛津公司;UV-2550紫外可见分光光度计日本岛津分析仪器厂;FA2104电子天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司;DD-5M型低速离心机湘仪离心机有限公司;SY-2000旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;SHZ-Ⅲ循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂;BAO-150AG型电热恒温干燥箱上海亚荣生化仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1野生樱桃李枝、叶不同萃取部位提取工艺参照翁文江等方法[11],分别称取备用野生樱桃李枝(2.0 kg)与叶(1.0 kg),以甲醇室温下浸提3次(每次7 d),合并滤液减压浓缩得树枝总浸膏176 g,树叶总浸膏193 g。分别将浸膏悬浮于300 mL蒸馏水中,加入等量的石油醚,摇匀3 min,放气后静置1 h,收集上层石油醚萃取物。下层水相同法萃取2次,合并萃取液,剩余水相按照上述方法依次用等量的乙酸乙酯、正丁醇萃取。将所得滤液浓缩、冷冻干燥至恒重,得树枝石油醚萃取物(PBPE,7.73 g)、树枝乙酸乙酯萃取物(PBEA,9.88 g)、树枝正丁醇萃取物(PBBU,8.27 g);树叶石油醚萃取物(PLPE,8.36 g)、树叶乙酸乙酯萃取物(PLEA,5.52 g)、树叶正丁醇萃取物(PLBU,3.45 g),保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2总酚含量的测定参照张毛莉等方法[12]制作标准曲线。分别取不同浓度的各萃取相溶液1 mL于25 mL比色管中,加入1.0 mL福林酚试剂,摇匀静置4 min,加入2 mL 7.5 g/L碳酸钠溶液,蒸馏水定容。将上述溶液避光室温放置2 h,以蒸馏水为空白参比,在760 nm波长处测定吸光度。取吸光度在线性范围内的数据,根据标准曲线测定各组分的总酚含量(以没食子酸计)。

1.2.3清除DPPH自由基实验参照陈乃东等方法[13]并稍加修改:分别量取系列浓度(0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL)的各萃取物、VC与BHA 0.5 mL于10 mL比色皿中,分别加入0.5 mL浓度0.6 mmol/L的DPPH乙醇溶液,将混合液用乙醇定容到5 mL,取0.5 mL DPPH缓冲液用乙醇定容到5 mL做对照实验。室温下避光放置30 min,以乙醇溶液做空白实验,测定混合物在517 nm处的吸光度,每组样品进行三次平行实验。DPPH自由基清除率按如下公式计算:

式中:A1为DPPH缓冲液的吸光度,A2为加入受试样品后DPPH混合液的吸光度。

1.2.4还原能力测定参照文献方法[14]并稍加修改:分别量取系列浓度(0.05,0.1,0.15,0.2,0.25 mg/mL)的各萃取物、BHA 2.5 mL于10 mL比色皿中,分别加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL铁氰化钾(1%)。将混合物放置到50 ℃的水浴中保温20 min后,加2.5 mL三氯乙酸,3000 r/min离心10 min,取2.5 mL上清液分别加入2.0 mL蒸馏水和0.5 mL氯化铁溶液(0.1%),以乙醇溶液做空白实验,测定混合物在700 nm处的吸光度,每组样品进行三次平行实验。

1.2.5总抗氧化能力的测定参照周寿然等方法[15]并稍加修改:分别量取系列浓度(0.15,0.2,0.25,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL)的各萃取物、BHA 0.5 mL于10 mL比色皿中,加入4.5 mL磷钼酸缓冲溶液,取0.5 mL乙醇和4.5 mL试剂溶液做空白对照,混匀后在95 ℃水浴中保温1.5 h,在695 nm处测定吸光度,每组样品进行三次平行实验。

1.2.6PLEA水解条件参考张英等[16]方法,将10 mg的PLEA溶于10 mL甲醇,加入2 mL 4 moL/mL的盐酸水溶液,70 ℃水浴下低速搅拌1.5 h,停止反应。

1.2.7色谱条件InertSustain C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温25 ℃;流动相水(A)-甲醇(B)梯度洗脱(0～10 min,40%～45% B,10～30 min,45%～80% B,30～50 min,80%～60% B),流速0.8 mL/min,检测波长254 nm,进样量20 μL。

2　结果与分析

2.1野生樱桃李枝、叶各萃取相的总酚含量

按照1.2.2的方法,以质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程:Y=0.01272+0.01069X(R2=0.9990),表明样品检测浓度在19.75～69.25 μg/mL内线性关系良好。根据标准曲线计算野生樱桃李枝、叶各萃取相的总酚含量列于表1。

由表1可知,各萃取相均含有酚类物质,其中野生樱桃李枝与叶的乙酸乙酯萃取物中总酚含量最高,分别为(263.76±3.08) mg/g和(220.48±4.86) mg/g,正丁醇相次之,提示野生樱桃李枝与叶萃取物中富含中等极性酚类物质。石油醚萃取物中总酚含量较少,各萃取相总酚含量存在显著性差异。

2.2野生樱桃李枝、叶各萃取相抗氧化实验结果

表1　野生樱桃李枝、叶各萃取相的总酚含量Table 1　Contents of total phenols in the extracts from Prunus divaricata Ldb Branches and Leaves

注:同行字母不同表示数据存在差异(p<0.05)。

2.2.1清除DPPH自由基活性在多种快速评估抗氧化活性的方法中,清除DPPH自由基模型与其它方法相比更为广泛使用。由图1可知,在测定浓度范围内,各受试样清除DPPH自由基活性差异显著。当供试质量浓度小于0.6 mg/mL时,各萃取相活性与浓度量效关系明显,其中活性较好的萃取相为PBEA、PBBU、PLEA。在质量浓度为0.6 mg/mL时,三者对DPPH清除率分别为91.9%、90.7%、82.1%,远高于BHA活性(34.7%),与VC活性(96.2%)接近,此后三者活性呈浓度饱和型特征。其余萃取相在测试浓度内,呈现出浓度依赖性。在同等供测质量浓度下,PLBU活性较BHA活性好,PBPE活性与BHA活性相近,PLPE活性最差,在质量浓度为1.0 mg/mL时最高清除率仅为33.5%。

图1　待测物清除DPPH活性Fig.1　DPPH scavenging activity of the test compounds

2.2.2还原能力大多数化合物的还原能力可以看作是其潜在抗氧化活性的重要指标。由图2可知,在测定浓度范围内,PBEA和PBBU表现出较强的还原能力,显著高于其它萃取物与BHA。PLEA和PLBU表现出与BHA相近的还原能力,且还原能力随着浓度的增大而不断增大,量效关系较为明显。树枝与树叶石油醚相还原能力较差,推测其含有的酚类化合物极性较小,还原能力较弱;乙酸乙酯相与正丁醇相含有中等极性的酚类化合物,具有较好的还原能力。

图2　待测物的还原能力Fig.2　 Reducing power of the test compounds

2.2.3总抗氧化活性由图3可知,各萃取相之间总抗氧化活性差异显著。在测定质量浓度下,PLPE总抗氧化活性最差,PLBU、PBPE与BHA总抗氧化活性相近;其余萃取相总抗氧化活性均高于BHA,强弱顺序为PBBU

图3　待测物的总抗氧化能力Fig.3　Total antioxidant capacity of the test compounds

2.3野生樱桃李枝、叶各萃取相总酚含量与抗氧化相关性分析

有研究表明,樱桃李等核果中的抗氧化活性与总酚含量紧密相关[10]。本研究参考邱高翔等[17]方法,考察了不同萃取相的抗氧化活性与其所含总酚的相关性。野生樱桃李枝、叶各萃取相总酚含量与DPPH自由基清除活性、总抗氧化活性之间存在显著的相关性,相关系数均大于0.9,说明总酚为野生樱桃李枝、叶抗氧化作用的主要活性成分,且总酚含量越高其活性越好。野生樱桃李枝、叶各萃取相总酚含量与还原能力之间的相关系数分别为0.783和0.705,推测是各萃取相酚类化合物构成差异大,导致总酚含量与还原能力相关性不显著。

2.4野生樱桃李枝、叶乙酸乙酯相化学成分HPLC初步分析

基于活性实验筛选结果,实验选取活性较优的PBEA与PLEA为研究对象,利用HPLC-DAD法对其化学成分进行了初步的分析,结果如图4、图5所示。

图4　PBEA(A)和PLEA(B)的HPLC谱图Fig.4　HPLC spectrum of PBEA(A)and PLEA(B)

图5　乙酸乙酯萃取物典型紫外吸收谱图Fig.5　The typical UV spectrum of ethyl acetate extract

在相同的HPLC色谱条件下,由图4可知树枝与树叶乙酸乙酯萃取物化学成分构成差异显著,PBEA极性相对较大,图4A中峰1～峰6紫外吸收谱图相似,表现为图5所示紫外谱图,最大吸收峰出现在230 nm与280 nm附近,推测为一类物质。图4A中峰7与图4B峰1～峰5紫外吸收谱图相似,表现为图5所示紫外谱图,最大吸收峰出现在265 nm与347 nm附近,为山奈酚糖苷类化合物的典型紫外吸收波长[18-19]。按照1.2.6实验方法将PLEA水解产物与山奈酚标准品经TLC和HPLC比对,证实PLEA水解产物以山奈酚为主要成分。各萃取相成分分析还需进一步分离纯化与鉴定。

3　结论

实验结果表明野生樱桃李枝、叶提取物均具有一定的抗氧化活性,且呈浓度依赖性。枝、叶各萃取相抗氧化活性呈现相似的规律:乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相,说明乙酸乙酯和正丁醇可以有效地富集野生樱桃李枝、叶抗氧化成分。不同萃取相的DPPH自由基清除活性、总抗氧化活性与其所含总酚量呈显著相关性,但还原能力与总酚含量相关系数小于0.9,推测不同萃取相酚类化合物构成差异较大,结构存在差异的物质对不同体系的抗氧化作用可能不同。树枝各萃取相抗氧化活性较相应的叶萃取相高,其中树枝乙酸乙酯相抗氧化活性最好,显著高于BHA。经HPLC初步分析,树枝与树叶乙酸乙酯萃取物化学成分构成差异显著,且各自所含化合物的极性相近,因此分离纯化过程会相对复杂。关于野生樱桃李枝、叶提取物成分分离纯化、活性构效关系还有待进一步研究。

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Study on antioxidant activity of different parts partitioned fromPrunusdivaricataLdb branches and leaves in Xinjiang

LIU Wei,LI Zi-wei,CHEN Wen-qiang,ZHU Yan,OUYANG Yan*

(University and College Key Lab of Natural Product Chemistry and Application in Xinjiang,Yili Normal University,Xinjiang Yining 835000,China)

The petroleum extract,ethyl acetate extract and n-butanol extract ofPrunusdivaricataLdb branches and leaves were obtained by systematic solvent extraction,and their antioxidant activities were evaluated by scavenging activity of DPPH radicals,reducing power and total antioxidant activity. The total phenolic content in the obtained extracts were measured. The results showed that the antioxidant activities of the extracts were positively correlated to their total phenolic content,it showed that total phenolic content were main factors for the antioxidant activities. Each part of extracts had antioxidant activities and similar tendency,the ethyl acetate extract displayed the strongest activity,followed by n-butanol extract and the petroleum extract. This indicated that the ethyl acetate extract and n-butanol extract were rich in antioxidant components. The ethyl acetate extract of branches had the strongest activity,remarkably higher than that of BHA. The total phenolic content fromPrunusdivaricataLdb branches and leaves could be produced as natural antioxidants.

PrunusdivaricataLdb;antioxidant activity;total phenolic content;HPLC

2015-06-05

刘伟(1985-)，硕士，实验师，研究方向：天然产物化学，E-mail:nculiuwei@126.com。

欧阳艳(1965-)，博士，教授，研究方向：天然产物研究、有机合成，E-mail:ylsyoyy@126.com。

新疆维吾尔自治区高校科研计划资助(XJEDU2014S061)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)03-0119-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.016