小儿腹股沟斜疝发病与腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的关系

尉迟今新，黄慧洁，刘畅，邹大军，徐晓青（承德医学院附属医院，河北承德067000）

小儿腹股沟斜疝发病与腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的关系

尉迟今新，黄慧洁，刘畅，邹大军，徐晓青
（承德医学院附属医院，河北承德067000）

目的 探讨小儿腹股沟斜疝发病与腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的关系。方法 采用免疫组化法和Western blotting法检测35例腹股沟斜疝患儿（病例组）和30例非疝患儿（对照组）腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的分布与含量。结果 病例组腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白经免疫组化染色后的镜下形态均呈连续性分布，排列整剂，无中断，与对照组相比无统计学差异（P均＞0.05）；病例组腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量分别为203.48 ±16.76、216.82±19.25，对照组分别为196.68±17.26、219.66±18.92，两组相比无统计学差异（P均＞0.05）。病例组与对照组Ⅰ型+Ⅲ型胶原蛋白含量分别为419.30±21.18、416.34±19.63，Ⅰ型/Ⅲ型分别为0.93±0.05、0.90±0.06，两组相比，P均＞0.05。结论 小儿腹股沟斜疝的发病与腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白代谢紊乱无明显关系。

小儿腹股沟斜疝；Ⅰ型胶原蛋白；Ⅲ型胶原蛋白

小儿腹股沟斜疝（PIH）是小儿普外科常见病，发病率1%～4%，右侧与左侧发病比例约2.5∶1［1］。传统学说认为腹膜鞘状突未闭合致本病发生［2］。但Williams等［3］曾报道，15%～30%无腹股沟疝患者亦有未闭合的鞘状突存在。近年来有学者发现成人腹股沟疝患者腹横筋膜中存在Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白代谢的紊乱，证实胶原蛋白代谢紊乱引起的腹横筋膜机械稳定性降低是成人腹股沟疝发病的直接原因。2014年10月～2015年2月，我们检测了腹股沟斜疝患儿腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达，旨在探讨小儿腹股沟斜疝发病与腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 腹股沟斜疝患儿35例（病例组），男32例、女3例，年龄（6.01±1.94）岁。另选取其他非疝手术患儿30例作为对照组，男28例、女2例，年龄（6.03±2.01）岁。两组年龄、性别具有可比性。入组患儿均获得家长同意。排除标准：结缔组织病、贫血、糖尿病、感染性疾病、被动吸烟、恶性肿瘤等。

1.2 腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达检测 病例组标本切取自腹股沟斜疝患儿腹横筋膜，面积0.5 ～1 cm2。对照组标本切取自非疝的其他手术患儿相同部位腹横筋膜，面积0.5～1 cm2。术中切取标本后一部分用100 mmol/L的中性甲醛溶液固定24 h，修整组织块，常规方法制成蜡块行免疫组化法检测；另一部分用液氮保存备用行Western blotting法检测。免疫组化法：将蜡块做成5 μm切片，用电热恒温箱80℃烘烤50 min后二甲苯脱蜡。3%过氧化氢室温孵育10 min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，放入100℃的0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）中，抗原热修复15 min，室温放置40 min，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加Ⅰ抗50 μL（HGF 1 ∶60工作液；c-met 1∶100工作液），置4℃冰箱过夜。PBS洗3次，每次5 min。滴加Ⅱ抗，室温孵育15 min。PBS洗3次，每次5 min。DAB显色5 min，终止显色，蒸馏水冲洗。苏木素复染，透明、封片、镜检。Western-blotting法：标本在液氮冷冻状态下研磨成粉，酸性条件下以10%胃蛋白酶消化22 h。离心1 h，2 mol/L NaCl加入上清，-4℃19 000 r/min离心1 h。按BCA法测定并调平蛋白质浓度。变性，电泳2 h，将PAGE凝胶中的蛋白通过电转移槽转移至PVDF膜上，2 h，电压40 V。TBS洗膜1次，加入含8%BSA的TBS，4℃过夜。TBS洗膜3次，每次5 min，分别加入兔抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体和兔抗人Ⅲ型胶原单克隆抗体（1∶1 000），室温下2 h。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶200），室温4 h。用1 mL的ECL混合发光液，孵育PVDF 膜3 min后显影。用化学发光仪采集图像，应用Quantity One生物图像处理软件对免疫印迹条带进行灰度值分析，以灰度值代表实际蛋白含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量数据以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本研究标本中的胶原蛋白经免疫组化染色后呈棕黄色，镜下可见病例组腹横筋膜中Ⅰ型和Ⅲ型胶原均呈连续性分布，排列整齐，无中断，同对照组相比无明显差别。病例组与对照组腹横筋膜胶原蛋白灰度值及比值的均数比较见表1。病例组腹横筋膜标本中Ⅰ型胶原蛋白灰度值、Ⅲ型胶原蛋白灰度值、Ⅰ型+Ⅲ型胶原蛋白灰度值、Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白灰度比值与对照组相比均无统计学差异（P均＞0.05）。灰度值与组织中实际的蛋白含量呈近似反比关系，因此腹股沟斜疝患儿腹横筋膜中实际的Ⅰ型胶原蛋白含量、Ⅲ型胶原蛋白含量、Ⅰ+Ⅲ型胶原蛋白总量、Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白比值与非疝患儿相比均无统计学差异（P均＞0.05）。

表1 病例组与对照组腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白灰度值及其比值比较±s）

表1 病例组与对照组腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白灰度值及其比值比较±s）

组别n 胶原蛋白类型Ⅰ型Ⅲ型Ⅰ型+Ⅲ型Ⅰ型/Ⅲ型病例组35203.48±16.76 216.82±19.25 419.30±21.180 1.466 P .93±0.05对照组30196.68±17.26 219.66±18.92 416.34±19.630.90±0.06 t 1.6080.5980.581 0.1480.1130.5520.563

3 讨论

早在古埃及时代人类就已发现并命名疝这一疾病［4］。疝的定义为体内某个脏器离开正常解剖部位，通过先天或后天形成的薄弱点、缺损进入另一部位，其病因学至今尚未能完全明确。近年来研究发现成人腹股沟疝患者腹横筋膜中存在胶原蛋白代谢的紊乱，认为胶原蛋白代谢紊乱引起的组织机械稳定性降低是成人腹股沟疝发病的直接原因。

胶原蛋白占人类体内蛋白质的25%～30%，相当于人体质量的6%［5］，人体组织的生物力学强度和基本构架的维持主要依赖胶原分子的稳定［6］。在人体结缔组织特别是筋膜中最主要的胶原是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原［7］。Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原加在一起可占95%［8］。其中有相对成熟特点的Ⅰ型胶原所形成的纤维直径粗，弹性张力和强度较高，而Ⅲ型胶原是幼稚的、相对不成熟的，所以其形成的纤维直径较细，这导致Ⅰ型胶原形成的纤维强度和弹性张力比Ⅲ型胶原高。组织的结构和强度由调节原纤维直径的Ⅰ型与Ⅲ型胶原比例决定［9］。组织机械稳定性的降低由Ⅰ型与Ⅲ型胶原比例下降导致［9］。

腹横筋膜是维系腹壁结构稳定的重要成分，而腹横筋膜的稳定依赖于其中Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白代谢的正常。近年来有学者对成人腹股沟疝患者腹横筋膜中胶原蛋白代谢进行了深入研究。李剑等［10］认为Ⅰ型与Ⅲ型胶原比例下降与成人腹股沟疝的发生及术后复发有直接关系，而这一变化的原因是幼稚的Ⅲ型胶原增加。Friedman等［11］发现腹股沟斜疝患者腹横筋膜中Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白比例降低，成人腹股沟疝的发病可能与系统性胶原代谢紊乱有关。上述研究结果均证实成人腹股沟疝患者腹横筋膜Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白比例降低，而组织机械稳定性与Ⅰ型/Ⅲ型胶原值呈正比关系，从而使组织机械稳定性降低导致成人腹股沟疝的发生。

本研究结果显示，腹股沟斜疝患儿腹横筋膜中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白免疫组化后的镜下形态与非疝患儿相比无明显差别。Western blotting法测定的腹股沟斜疝患儿腹横筋膜中Ⅰ型胶原蛋白含量、Ⅲ型胶原蛋白含量、Ⅰ型+Ⅲ型胶原蛋白总量及Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白值与非疝患儿相比无统计学差异。由此推测小儿腹股沟斜疝发病与患儿腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白代谢紊乱不相关。与成人腹股沟疝的发病机制不同。这一结论为小儿腹股沟斜疝和成人腹股沟疝在治疗方面的差异提供了理论依据。王果等［12］报道，小儿腹股沟斜疝修补术后复发率为1.0%～2.5%，而采用自身组织进行修补的成人腹股沟疝术后复发率高达10%［13］，这是因为小儿腹股沟斜疝患儿腹横筋膜中无胶原代谢紊乱，其机械稳定性未降低，可作为手术修补材料，不必采用生物合成补片。

综上所述，小儿腹股沟斜疝的发病与腹横筋膜中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白代谢紊乱无明显关系。本研究受样本来源的限制，纳入患儿的年龄为2～9岁，严格意义上不能代表全部儿童，其他年龄段儿童腹横筋膜中是否存在胶原蛋白代谢紊乱尚需进一步研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.030

R657.8

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1002-266X（2016）25-0085-03

2015-10-11）