聚肌胞增强肝癌细胞HepG2对甲氨蝶呤化学敏感性的机制

王丽（河南科技大学第一附属医院，河南洛阳471003）

聚肌胞增强肝癌细胞HepG2对甲氨蝶呤化学敏感性的机制

王丽
（河南科技大学第一附属医院，河南洛阳471003）

目的 探讨聚肌胞（PolyI：C）增强肝癌细胞对甲氨蝶呤（MTX）化学敏感性的机制。方法 体外培养肝癌细胞HepG2，并随机分成对照组、MTX组、联合组，对照组加入生理盐水，MTX组加入MTX至20 μg/mL，联合组加入MTX至20 μg/mL和PolyI：C至50 μg/mL。MTT法检测各组细胞增殖抑制率，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，PCR法检测各组细胞中维甲酸诱导基因1（RIG-1）、干扰素β（IFN-β）和半胱胺酸天冬胺酸转移酶3（Caspase-3）mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表达。结果 联合组与MTX组相比，细胞增殖抑制率和凋亡率均显著升高，而RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平亦显著提高两组比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 PolyI：C通过上调RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表达，促进肝癌细胞的抑制和凋亡，从而增强MTX对肝癌细胞的化学敏感性。

肝肿瘤；聚肌胞；甲氨蝶呤；化学敏感性

肝细胞肝癌（HCC）是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤，仅有小部分可进行切除或进行肝移植，大部分患者需行药物治疗［1］。甲氨蝶呤（MTX）是肝细胞癌的化疗药物之一，但长期大剂量使用MTX，正常肝细胞会引起损伤，肝癌细胞亦可产生耐药性［2］。聚肌胞（PolyI：C）是一种人工合成双链RNA，可于体内诱导不同细胞产生干扰素α和干扰素β（IFN-β）［3］。研究表明，PolyI：C在诱导干扰素产生的同时，可抑制肿瘤细胞生长［4］。2014年3月～2015年4月，我们通过PolyI：C联合MTX作用于肝癌细胞株HepG2，观察肝癌细胞HepG2对MTX化学敏感性的变化并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清、DMEM细胞培养基购自Gibico公司；胰酶购自Amresco公司；TRIzol试剂和转染脂质体Lipofectamin2000均购于Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自Thermo公司。注射用MTX购自齐鲁制药公司；聚肌胞购自广东邦民制药厂。鼠抗人RIG-1单克隆抗体、鼠抗人IFN-β单克隆抗体、鼠抗人Caspase-3单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG均购自Santa Cruz公司；肝癌细胞株HepG2细胞为本实验室保存。

1.2 细胞培养及分组 肝癌细胞HepG2使用含10%FBS的高糖DMEM，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养，细胞生长至90%融合，用0.25%胰酶消化细胞，将HepG2细胞浓度调整为5×104/mL，种入6孔培养板和96孔培养板，细胞过夜贴壁后换液，并分成三组，即对照组、MTX组和联合组，对照组加入生理盐水，MTX组加入MTX至20 μg/mL，联合组加入MTX至20 μg/mL和PolyI：C至50 μg/ mL；6孔板每组设3个平行孔，96孔板每组设12个平行孔，加药后继续培养72 h。

1.3 细胞增殖抑制率测算 采用MTT法。将分组加药处理的96孔板细胞拿出培养箱，每孔加入5 mg/mL的MTT试剂20 μL，置37℃、5%CO2培养箱继续培养4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL/孔，于振荡器上振荡5 min，用酶标仪检测每孔570 nm波长处的OD值。根据公式计算出HeLa细胞增殖抑制率：抑制率（IR）=（对照组OD值均数-实验组OD值均数）/对照组OD值均数。实验重复进行3次。

1.4 细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。将分组处理的6孔板细胞用0.25%的胰酶将细胞消化后，分别加入完全培养基终止消化，吹打混匀，2 000 r/ min离心5 min，用PBS洗涤细胞1次，2 000 r/min离心5 min收集细胞沉淀，重悬细胞，分别加入PI染色液避光静置5 min，最后用75%乙醇固定，流式细胞仪检测。

1.5 细胞维甲酸诱导基因1（RIG-1）、IFN-β和半胱胺酸天冬胺酸转移酶3（Caspase-3）mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。将分组加药处理72 h的6孔板细胞按照一步法提取细胞中总RNA，准确定量2 μg RNA，使用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。各取等量基因使用SYBGreen染料进行实时定量细胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表达检测。PCR条件：95℃预变性5 min进入循环，95℃变性15 s，60℃退火延伸60 s并读取荧光值，共45个循环，获取Ct值，计算mRNA相对表达量。

1.6 细胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表达检测采用蛋白免疫印迹法。收集6孔板处理的三组细胞，加入细胞裂解液，混匀后置冰上15 min，13 000 r/min，离心5 min，收集上清液用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。分别取等量蛋白电泳，湿式电转移法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，再用3%脱脂牛奶室温封闭2 h。分别加鼠抗RIG-1单克隆抗体、鼠抗IFN-β单克隆抗体和鼠抗Caspase-3单克隆抗体为一抗（1∶1 000），以鼠抗人β-actin单克隆抗体为内参抗体（1∶2 000）。4℃孵育过夜，PBST洗膜3次。加入HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗（1∶2 000），37℃孵育2 h，PBST洗膜3次。于暗室滴加ECL化学发光液，然后压片、显影、定影。实验重复3次。应用Scion Image软件分析灰度值，蛋白相对定量值=目的基因灰度值/内参基因灰度值。

1.7 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。以One-Way ANOVA模块对各组检测指标进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率及凋亡率比较 与对照组比较，MTX组和联合组对HepG2细胞增殖均具有明显抑制作用（P均＜0.05）；而联合组与MTX组比较，HepG2细胞增殖抑制更明显（P＜0.05）。与对照组相比，MTX组和联合组细胞凋亡率均升高（P均＜0.05），联合组细胞凋亡率比MTX组更高（P＜0.05）。见图1。

图1 各组细胞增殖抑制率和凋亡率比较

2.2 各组细胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表达比较 联合组细胞RIG-1、IFN-β mRNA水平高于对照组和MTX组（P均＜0.05），对照组和MTX组比较无统计学差异（P＞0.05）。MTX组和联合组细胞中Caspase-3 mRNA水平均高于对照组（P均＜0.05），而联合组Caspase-3 mRNA水平比MTX组更高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表达比较

2.3 各组细胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白水平比较 联合组细胞RIG-1、IFN-β蛋白水平高于对照组和MTX组（P均＜0.05），MTX组和对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。而MTX组和联合组细胞Caspase-3蛋白水平均高于对照组（P均＜0.05），联合组中水平比MTX组更高（P＜0.05）。见图3。

图3 各组细胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表达比较

3 讨论

肝癌传统治疗包括手术、放疗和化疗等多种方法［5］。手术和放疗仅在肿瘤早期、部位局限时应用，中晚期肝癌患者多数需药物化疗。但多数中晚期肝癌对MTX、氟尿嘧啶、顺铂等化疗药物敏感性不高，尤其是单药治疗有效率更低［6］。

PolyI：C是一种病毒双链RNA的模拟物。有文献报道，其不仅对免疫细胞（如自然杀伤细胞）具有激活作用，而且还可直接诱导肿瘤细胞凋亡［7］。其一方面可与Toll受体3（TLR3）结合，激活TLR3通路，发挥天然免疫和抗肿瘤免疫作用；另一方面，PolyI：C于体内诱导不同细胞产生干扰素。干扰素是体内多种细胞释放的一种糖蛋白，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。因此PolyI：C已作为一种有效的抗肿瘤免疫佐剂被广泛研究，既可单独用作免疫治疗，亦可结合其他免疫药物及细胞毒药物而应用。

Caspases活性变化是细胞凋亡的重要调节机制，Caspases是所有凋亡信号传导的共同通路［8］。目前已发现在人体内的Caspases共有14种，其中起核心作用的是Caspase-3［9］。Caspase-3与肝癌亦有密切关系［10］，Caspase-3是抗肿瘤药物作用的极好靶点［11］。研究表明，细胞对MTX反应性很大程度上依赖于细胞p53和Caspases的功能［12］。本研究显示，联合组、MTX组与对照组相比，RIG-1、IFN-β 和Caspase-3表达均显著上调；同时联合组的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率明显高于MTX组和对照组。证实PolyI：C能增强肝癌细胞对MTX的化学敏感性，其机制可能为PolyI：C通过激活TLR3通路，上调RIG-1，诱导IFN-β表达，同时激活Caspase-3抑制了肝癌细胞的增殖，促进了肝癌细胞的凋亡，增强了化疗效果。

综上所述，PolyI：C通过上调RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表达，促进肝癌细胞的抑制和凋亡，从而增强MTX对肝癌细胞的化学敏感性。

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2016-04-06）