海洋骨胶原低聚肽钙的分离纯化及结构鉴定

刘文颖,任　玮,谷瑞增,鲁　军,蔡木易

(中国食品发酵工业研究院,北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京 100015)



海洋骨胶原低聚肽钙的分离纯化及结构鉴定

刘文颖,任玮,谷瑞增,鲁军*,蔡木易*

(中国食品发酵工业研究院,北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京 100015)

以三文鱼骨作为原料,以碳酸钙作为钙源制备出海洋骨胶原低聚肽钙,对其总蛋白含量、螯合率、得率进行测定,结果表明总蛋白含量为62.56%±0.26%,螯合率为51.38%±0.09%,螯合物得率为42.06%±0.10%。然后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对其进行分离纯化,收集得到8个组分峰,利用Q-TOF质谱仪测定肽序列,共分析出22个肽段,分子量大多在1000 u以下。

海洋骨胶原低聚肽,肽钙螯合物,分离纯化,结构鉴定

钙是人体必需的常量元素,参与机体多种生理活动。缺钙是全球性营养问题,在我国缺钙现象更加严重。因此,高效、经济的补钙制剂的研发是当今社会急需解决的问题。三文鱼属于硬骨鱼纲鲑形目鲑亚目鲑科的种类,是世界上最有益健康的鱼类之一。三文鱼骨是三文鱼加工过程中产生的副产品,大部分作为饲料鱼粉的原料或废料丢弃,既污染环境,又造成经济上的损失[1-2]。以三文鱼骨为原料,通过酶解制得海洋骨胶原低聚肽,能够回收利用鱼骨中的胶原蛋白,并且具有天然、安全性高等优点[3-4]。

低聚肽能够与钙离子形成螯合物,与其他补钙剂相比,更易被快速吸收,稳定性更好,能有效地将钙离子释放出来,同时还能补充一定的氨基酸[5-6]。国内外已有一些学者研究了肽钙螯合物的制备工艺、补钙作用[5-7],但关于海洋骨胶原低聚肽的分离纯化和结构鉴定方面的研究报道却十分少见。因此,本文以三文鱼骨作为原料,以碳酸钙作为钙源,制备了海洋骨胶原低聚肽钙,在对其总蛋白含量、螯合率、得率进行分析的基础上,采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对其进行分离纯化,利用Q-TOF质谱仪鉴定出肽段结构,为新型活性肽补钙剂的开发及三文鱼骨资源的利用提供理论依据。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

三文鱼骨北京中食海氏生物技术有限公司提供;碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶(2.4 AU/g)诺维信生物技术有限公司;无水氯化钙、无水乙醇北京化学试剂公司,分析纯;乙腈美国Fisher公司,色谱纯;三氟乙酸英国Alfa Aesar公司,分析纯。

HH-4数显恒温水浴锅普瑞斯机械有限公司;YG30喷雾干燥机无锡市阳光干燥设备厂;LC-20AD型高效液相色谱仪日本岛津公司;Q-TOF2正交加速电喷雾串联质谱仪英国Micromass公司。

1.2实验方法

1.2.1海洋骨胶原低聚肽钙的制备三文鱼骨粉碎成鱼骨粉→溶解于蒸馏水中→90℃热水中加热10 min→调节温度为50℃,pH为8.5→以每克蛋白质2000单位的酶量加入碱性蛋白酶,酶解3 h→调节温度为60℃,pH为7→以每克蛋白质3000单位的酶量加入木瓜蛋白酶,酶解2 h→100℃灭酶10 min→10000×g离心30 min,取上清液→用截留分子量1000 u的超滤膜进行超滤,得到分子量小于1000 u的滤过液→用喷雾干燥器进行喷雾干燥,得到海洋骨胶原低聚肽干粉→将3 g海洋骨胶原低聚肽和1 g无水氯化钙溶解于100 mL蒸馏水中→于50℃下水浴反应60 min→冷却至室温→调节pH为5,加入4倍体积的无水乙醇,室温放置1h→抽滤收集沉淀,干燥后得到海洋胶原低聚肽钙干粉→干燥器中保存[7]。

1.2.2海洋骨胶原低聚肽钙指标测定总蛋白质含量测定采用凯氏定氮法[8],以干基计,蛋白质换算系数为6.25。计算公式为:总蛋白质含量(%)=N×6.25/W×100,N为测定出的氮含量(mg),W为海洋骨胶原低聚肽钙的质量(mg)。

螯合率和得率的测定参照文献[9]。采用EDTA络合滴定法测定钙的含量,每毫升EDTA-2Na滴定液(0.05 mol/L)相当于2.0039 mg钙。螯合率(%)=M1/M0×100,M1为螯合物中钙的量(mg);M0为加入反应体系中钙的总量(mg)。螯合物得率(%)=W1/W0×100,W1为海洋骨胶原低聚肽钙的总量(mg),W0为海洋骨胶原低聚肽与氯化钙的总质量(mg)。

1.2.3RP-HPLC分离海洋骨胶原低聚肽钙利用RP-HPLC对海洋骨胶原低聚肽钙进行分离纯化。色谱条件为:样品质量浓度:10 mg/mL;流动相A:V(水)∶V(三氟乙酸)=100∶0.1;流动相B:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=80∶20∶0.1;检测波长:UV 220 nm;流速:0.6 mL/min;柱温:32℃;进样体积:100 μL。梯度洗脱程序:0～10 min,流动相B:0%～5%;10～20 min,流动相B:5%～5%;20～35 min,流动相B:5%～9%;35～45 min,流动相B:9%～13%;45～60 min,流动相B:13%～13%;60～70 min,流动相B:13%～100%。分管收集8个组分峰,利用氮吹仪除去三氟乙酸、乙腈等有机溶剂,冷冻干燥备用[10]。

1.2.4Q-TOF MS测定分子质量及肽序列采用Q-TOF2正交加速电喷雾串联质谱仪进行结构鉴定,质谱条件为:离子化方式:纳升电喷雾正离子;雾化气体:N2;碰撞气体:Ar;源温:80℃;锥孔电压:50 V;TOF加速电压:9.1 kV;MCP检测器电压:2150 V;毛细管电压:800 V;MS和MS/MS的质量准确度:0.1 u。首先进行一级质谱扫描,得到ESI-MS图。从ESI-MS图中选出待测离子,然后进行ESI-MS/MS分析。质谱图经Micromass的MaxEnt 3转换后,由Peptide Sequencing推导出肽段序列。

2　结果与讨论

2.1海洋骨胶原低聚肽钙的总蛋白含量、螯合率和得率

海洋骨胶原低聚肽钙的总蛋白含量为62.56%±0.26%,螯合率为51.38%±0.09%,得率为42.06%±0.10%。表明海洋骨胶原低聚肽钙中蛋白质含量较高,并且具有较高的螯合率和得率。

2.2海洋骨胶原低聚肽钙的分离纯化

海洋骨胶原低聚肽是由多种小分子肽组成的混合物,与钙螯合后,分离纯化方法主要有超滤、高效液相色谱、离子交换层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤色谱等。其中,最常用也是最有效的方法就是RP-HPLC法。RP-HPLC是根据肽的极性强弱进行分离的,具有很好的分离效果。与其它色谱方法相比,RP-HPLC具有分辨率高、色谱过程稳定、重复性好、操作简便等优势[11]。如图1所示,利用RP-HPLC将海洋骨胶原低聚肽钙进行分离纯化,得到一系列的峰。根据峰形、峰高、峰面积和分离度四个指标,收集8个组分峰,进行质谱分析。C18柱分离能够使得相邻或相近极性的多肽富集在一起,极性/亲水性组分先被洗脱出来,而非极性/疏水性组分后被洗脱出来。因此,收集到的8个组分峰,极性是由强变弱的,每个组分峰里含有的可能不是单一肽段,通过质谱分析便可对肽段进行鉴定。

图1　海洋骨胶原低聚肽钙的RP-HPLC分离色谱图Fig.1　RP-HPLC separation chromatogram of MBCP-Ca

2.3海洋骨胶原低聚肽钙的肽序列测定

质谱分析法是按照离子的质核比(m/z)大小对离子进行分离和测定从而进行定性和定量分析的一种方法,它是目前测定分子量最准确且需要样品量最少的方法[11]。肽段在质谱中的断裂有一定的规律,在肽键处断裂,可以得到N端系列的碎片离子(b系列)和C端系列的碎片离子(y系列),这些碎片离子还可以进一步形成脱水、脱氨的离子。此外,除Phe、Tyr、Trp、和Ala外,氨基酸残基还可能发生侧链β碳和γ碳之间的断裂[12]。

利用质谱共从海洋胶原低聚肽钙的8个主要组分中分析出22个肽段序列,肽段结构具体信息见表1。19个肽段的分子量在1000 u以下,其余3个肽段分子量在1000～1050 u之间,均为不高于十肽的小肽。本中心前期研究结果表明,海洋胶原低聚肽钙中钙与多肽是以离子键和配位键形式结合的,也有一部分钙是以物理吸附形式沉积在多肽钙表面[13]。质谱分析中未发现Ca2+峰,说明Ca2+与小肽结合较弱,电离过程中Ca2+脱落,因此未检测出来。Bao等[14]和Kumagai[15]通过红外光谱分析法对大豆肽钙的构效关系进行了研究,结果表明大豆肽段能够通过Glu和Asp残基上的羧基与钙螯合[14-15]。鉴定出的22个肽段中,有17个肽段具有Glu或Asp残基,这表明Glu和Asp残基可能在海洋骨胶原低聚肽与钙的螯合过程中起到了关键作用。此外,有研究报道,Ser、Thr、Met、Tyr等氨基酸也具有促进肽钙螯合的作用[14],不具有Glu和Asp残基的5个肽段中,有4个肽段具有Ser或Thr残基。22个肽段中,只有1个肽段(Leu-Arg)不具备这些促进肽钙螯合的氨基酸,这表明可能是Leu与Arg之间的协同作用或者Leu-Arg的空间结构对肽钙的结合起到了一定的作用,还有待进一步研究探讨。

表1　Q-TOF MS鉴定出的海洋骨胶原低聚肽钙的肽段结构

3　结论

本研究以三文鱼骨为原料制备海洋骨胶原低聚肽钙,其总蛋白含量为62.56%±0.26%,螯合率为51.38%±0.09%,得率为42.06%±0.10%。利用RP-HPLC对其进行分离纯化,收集得到的8个组分峰,然后利用Q-TOF质谱仪测定肽序列,共分析出22个肽段。19个肽段的分子量在1000 u以下,其余3个肽段分子量在1000～1050 u之间,均为不高于十肽的小肽。氨基酸组成分析推测,Glu、Asp、Ser、Thr残基以及肽段的空间结构可能在海洋骨胶原低聚肽与钙的螯合过程中起到了关键作用。本研究为新型活性肽补钙剂的开发及三文鱼骨资源的利用提供了一定的理论依据,但关于海洋骨胶原低聚肽钙中鉴定出的肽段与钙的螯合作用机制还有待进一步研究。

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Separation,purification and structural identification of calcium-chelating Marine bone collagen oligopeptides

LIU Wen-ying,REN Wei,GU Rui-zeng,LU Jun*,CAI Mu-yi*

(Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

Calcium-chelating Marine bone collagen oligopeptides(MBCP-Ca)were prepared by using salmon bone as raw material and calcium carbonate as calcium resource.The total protein content,chelating rate and yield were determined.Results showed that the total protein content,chelating rate and yield were 62.56%±0.26%,51.38%±0.09% and 42.06%±0.10%,respectively.Then,MBCP-Ca was separated and purified by reversed phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC).A total of 8 fractions were collected and subjected to Q-TOF mass spectrometer to identify peptide sequences.A total of 22 peptide sequences were identified,and most molecular weights of the peptides were below 1000 u.

Marine bone collagen oligopeptides;calcium-chelating peptides;separation and purification;structural identification

2015-08-27

刘文颖(1984-)，女，硕士研究生，工程师，研究方向：食源性低聚肽研究，E-mail：wenyingliu888@126.com。

蔡木易(1962-)，男，本科，教授级高工，研究方向：功能肽研究与产业化，E-mail：caimuyi@vip.sina.com。

鲁军(1973-)，男，博士，高级工程师，研究方向：食品营养与生物技术，E-mail：johnljsmith@163.com。

国家十二五科技支撑项目(2012BAD33B04-02)；国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102205-02)；北京市科委农村中心国家现代农业科技城成果惠民科技示范工程项目(Z131100003113010)；科技北京百名领军人才培养工程项目(Z131110000513026)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)07-0049-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.001