糖尿病大鼠心肌组织内质网应激因子GRP78及caspase-12的表达及其对心脏结构和功能的影响

杨竞霄， 陈静园， 王子宽*

(1第四军医大学附属唐都医院心内科，西安　710038； 2火箭军工程大学门诊部； *通讯作者，E-mail：Wangzikuan@sohu.com)



糖尿病大鼠心肌组织内质网应激因子GRP78及caspase-12的表达及其对心脏结构和功能的影响

杨竞霄1， 陈静园2， 王子宽1*

(1第四军医大学附属唐都医院心内科，西安710038；2火箭军工程大学门诊部；*通讯作者，E-mail：Wangzikuan@sohu.com)

目的观察糖尿病大鼠心肌内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)相关因子GRP78和caspase-12表达的变化，探讨其对心脏结构和功能的影响。方法采用链脲佐菌素腹腔注射制备糖尿病大鼠模型，取15只造模成功的大鼠，随机分为0周组、8周组和16周组，每组5只。采用颈动脉插管法检测大鼠血压、心率及心功能的各项指标。称取体质量、全心质量及左心室质量，计算大鼠心肌肥厚指数HWI及LVEI。Masson染色观察心肌胶原纤维含量的改变，免疫组化及Western blot检测大鼠心肌组织中GRP78及caspase-12表达水平，Western blot检测cleaved caspase-3表达水平。结果三组大鼠血压及心率无统计学差异(P>0.05)。与0周组相比，大鼠平均左心室舒张末期压(LVEDP)及平均压下降最大速率(-dp/dtmax)在8周及16周时明显升高(P<0.05)；平均压力上升最大速率(+dp/dtmax)在16周时明显降低(P<0.05)。与0周组相比，大鼠心肌肥厚指标HWI及LVWI在8周时无明显变化(P>0.05)，HWI及LVWI在16周时明显升高(P<0.05)。与0周组相比，大鼠心肌Masson染色在8周和16周时心肌细胞排列紊乱，胶原纤维明显增多。与0周组相比，免疫组化及Western blot检测大鼠心肌组织GRP78表达8周时明显增高(P<0.05)，16周时GRP78表达明显降低(P<0.05)；caspase-12表达在8周时明显增高(P<0.05)，16周时显著增高(P<0.01)；Western blot检测cleaved caspase-3表达在8周时明显增高(P<0.05)，在16周时显著增高(P<0.01)。结论高血糖可以直接影响大鼠心肌结构和功能。高血糖早期GRP78表达的升高；随应激时间的延长， caspase-12及cleaved caspase-3表达明显升高。因此，心肌细胞ERS的激活可能是高血糖所致大鼠心肌结构和功能改变的原因之一。

糖尿病；内质网应激；心脏结构；GRP78；caspase-12；大鼠

糖尿病是心血管疾病的重要危险因素[1]。糖尿病心肌病是糖尿病最主要的心血管并发症，严重影响患者的生活质量[2]。既往研究认为高糖可以导致细胞葡萄糖代谢障碍、细胞内钙超载和氧自由基清除障碍，从而诱发相关并发症[3,4]。研究表明，高糖可能是触发细胞内质网应激的因素之一[5]。内质网应激是多种心血管疾病发生发展的共同分子机制之一，多种因素比如高血压、缺血缺氧及高同型半胱氨酸血症等病理因素均可引起细胞内质网腔内未折叠和错误折叠蛋白聚集及钙离子平衡紊乱，激活细胞内质网应激，过度或持续的应激导致保护因子GRP78、GRP94与促凋亡因子CHOP、caspase-12表达失衡，促凋亡因子CHOP、caspase-12表达占优势，最终激活细胞凋亡通路[6,7]。然而，高血糖是否诱导了心肌细胞ERS，导致应激因子GRP78和caspase-12表达的改变，以及其与心肌结构与功能改变的关系尚不清楚。本研究通过建立糖尿病大鼠模型，观察不同时间点糖尿病大鼠心肌细胞GRP78和caspase-12表达的变化，以及大鼠心肌结构和功能的改变，以探讨糖尿病心肌病发生发展的分子机制，为其防治提供新的思路。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器

链脲佐菌素(美国Sigma公司)，兔抗大鼠GRP78抗体及兔抗大鼠CHOP抗体(美国Abcam公司)，兔抗大鼠cleaved caspase-3抗体(美国CST公司)，碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生技术有限公司)，德国罗氏血糖仪及血糖试纸，BX41型光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；DP71型显微摄像系统(日本奥林巴斯株式会社)；图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)。

1.2动物模型的建立及实验分组

6-8周龄雄性SD大鼠20只，体质量180-200 g，由第四军医大学实验动物中心提供。大鼠禁食不禁水14-18 h，用柠檬酸盐缓冲液(pH=4.5)配制1%链脲佐菌素溶液,按60 mg/kg进行腹腔注射，注射后72 h断尾取血测空腹血糖，血糖高于16.7 mmol/L为糖尿病模型造模成功。将造模成功的15只糖尿病大鼠随机分为0周组、8周组和16周组，每组5只。

1.3大鼠血压及心功能的测定

将大鼠禁食12 h，麻醉后仰卧位固定于鼠板上，沿颈部正中线切开皮肤，分离右颈总动脉，远端结扎，近端以血管钳夹闭。于血管壁上做“V”形小切口，缓慢将连接压力换能器的测压导管插入右颈总脉，至升主动脉时用多道生理记录仪检测血压。随后插入左心室，可见宽大均匀波型，稳定10 min后，检测心脏功能的各项指标。心功能测定结束后，取血测血糖。

1.4心肌肥厚指数HWI及LVWI的测定

开胸取出大鼠心脏以4 ℃ PBS冲洗，剪去多余血管及脂肪组织，滤纸吸干，称取全心质量(HW)。快速剪去心房及右心室，保留室间隔及左心室，称取左室质量(LVW)。计算HWI(HW/BW)和LVWI(LVW/BW)比值。沿心脏长轴透壁剪开，分别置于液氮保存及4 g/L多聚甲醛中固定，用于Western blot及免疫组化检测。

1.5Masson染色检测大鼠心肌组织肌纤维化程度

取出置于4 ℃多聚甲醛(4 g/L)中固定24 h的大鼠心肌组织，酒精梯度脱水，石蜡包埋，沿纵轴连续切4 μm厚切片。经脱蜡后水化，先后用苏木素染色，丽春红酸性品红液中染色，1%磷铝酸染色，滴加苯胺蓝液后烘干，二甲苯透明树胶封片。光镜下观察，胶原纤维呈蓝色，胞核呈蓝色，肌纤维胞质呈红色。

1.6免疫组化检测大鼠心肌组织GRP78及CHOP的表达

将心肌组织的石蜡切片经烤片、脱蜡、水化、PBS洗涤后，30 ml/L双氧水封闭15 min。高温高压锅连续喷气3 min抗原修复，室温下山羊血清封闭20 min，滴加1:500稀释兔抗大鼠GRP78抗体孵育(4 ℃过夜)。复温20 min后PBS洗涤，滴加1∶500稀释羊抗兔IgG(37 ℃孵育25 min)，滴加DAB显色，复染、脱水、透明、中性树胶封片，镜下观察结果，测定平均光密度(OD)值，并进行定量分析。CHOP测定方法同GRP78。

1.7Western blot检测各组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP及cleaved caspase-3的表达

将心肌组织剪成细小碎块，加适量RAPA裂解液，置于冰上用玻璃匀浆器匀浆，静置60 min待其充分裂解，12 000 r/min 4 ℃离心15 min，取上清。BCA蛋白测定蛋白浓度，余上清加入1/4体积loading buffer，100 ℃沸水中煮5 min，-80 ℃保存。取等量蛋白样品于100 g/L SDS-PAGE凝胶恒压电泳分离并转至PVDF膜上。以50 g/L脱脂奶粉封闭1 h后，依次滴加1∶1 000兔抗大鼠GRP78、CHOP和cleaved caspase-3抗体(4 ℃振荡孵育过夜，TBST洗膜7 min×3次)，1∶7 000 HRP-羊抗兔IgG(室温振荡孵育2 h)，TBST洗膜7 min×3次，Bio-ray凝胶成像分析系统进行灰度扫描分析，计算A值。

1.8统计学分析

2　结果

2.1大鼠血压、心率及心脏功能指标的变化

三组大鼠SBP、DBP及HR未见明显差异(P>0.05，见表1)。与0周组相比，8周组大鼠LVP和LVPP略有下降，但未见明显统计学差异(P>0.05)；LVEDP则有明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。与0周组相比，16周组大鼠LVP和LVPP明显下降(P<0.05)，LVEDP下降更为明显(P<0.01)。与0周组相比，8周组大鼠+dp/dtmax值未见明显下降(P>0.05)，而16周组大鼠-dp/dtmax值有明显升高(P<0.05)；与0周组相比，8周组大鼠-dp/dtmax值可见明显升高(P<0.05)，16周组大鼠-dp/dtmax有显著升高(P<0.01，见表1)。

2.2大鼠空腹血糖及心肌HWI、LVWI的变化

随造模时间延长，糖尿病大鼠8周及16周组空腹血糖均显著高于0周组(P<0.01)，且8周组及16周组大鼠心肌HWI及LVWI均有不同程度增高。与0周组相比，8周组大鼠心肌HWI、LVWI稍有增高，但差异未见明显统计学意义(P>0.05)；与0周组相比，16周组大鼠心肌HWI、LVWI明显增高(P<0.05，见表2)。

组别SBP(mmHg)DBP(mmHg)LVP(mmHg)LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)HR(次/min)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)0周组113.85±8.9276.32±7.5185.17±6.06159.62±10.14-8.96±1.22428.26±21.367584.49±572.6 -6182.51±864.78周组107.64±9.2174.68±8.9681.49±8.13157.94±9.06-6.96±2.05#438.79±30.157226.53±487.92-5264.31±625.3#16周组112.02±8.7775.14±6.8475.25±9.68#138.72±10.14#-4.64±1.63##472.26±34.276207.52±831.7#-4584.49±964.7##

与0周组比较，#P<0.05，##P<0.01

组别 空腹血糖(mmol/L)HWILVWI0周组4.83±1.212.18±0.102.16±0.118周组22.70±2.86## 2.27±0.122.22±0.1316周组31.42±3.32##3.54±0.13#3.16±0.12#

与0周组比较，#P<0.05,##P<0.01

2.3大鼠心肌间质纤维化改变

Masson染色结果显示，0周组大鼠心肌组织呈暗红色、排列规整，其间未见明显的胶原纤维。8周组大鼠心肌组织排列紊乱，伴有蓝色胶原纤维增生。16周组大鼠心肌组织排列紊乱，伴较为明显的网状蓝色胶原纤维增生(见图1)。

图1　各组大鼠心肌组织Masson染色图 (×400)Figure 1　Masson stain of myocardial tissues in diabetic rats at different time (×400)

2.4免疫组化检测大鼠心肌组织GRP78、caspase-12表达的变化

GRP78、caspase-12表达位于胞质中，0周组大鼠心肌组织GRP78及caspase-12呈弱阳性表达(见图2，3)。与0周组相比，8周组大鼠心肌组织GRP78呈强阳性表达，可见大量棕黄色颗粒(见图2)；caspase-12呈阳性表达，可见较多棕黄色颗粒(见图3)。与0周组相比，16周组大鼠心肌组织GRP78呈阳性表达； caspase-12则呈强阳性表达，可见大量棕黄色颗粒(见图2，3)。

与0周组相比，8周组大鼠心肌组织GRP78和caspase-12表达显著升高(P<0.01，见图4)；16周组大鼠心肌组织GRP78表达(P<0.05)和caspase-12表达(P<0.01)显著增加。

图2　各组大鼠心肌组织中GRP78表达的免疫组化染色法检测(×400)Figure 2　Expression of GRP78 in myocardial tissues of diabetic rats at different time by immunohistochemical staining (×400)

图3　各组大鼠心肌组织中caspase-12表达的免疫组化染色法检测 (×400)Figure 3　Expression of caspase-12 in myocardial tissues of diabetic rats at different time by immunohistochemical staining (×400)

与0周组比较,*P<0.05, **P<0.01图4　各组大鼠心肌组织中GRP78和caspase-12表达OD值统计分析 Figure 4　Comparison of OD value of GRP78 and caspase-12 expression in myocardial tissues of diabetic rats at different time

2.5大鼠心肌组织Western blot检测GRP78、caspase-12及cleaved caspase-3表达的变化

0周组大鼠心肌组织中GRP78蛋白少量表达，8周组大鼠心肌组织GRP78表达显著高于对照组(P<0.01)，16周组GRP78表达略有降低，仍明显高于0周组(P<0.05)。caspase-12及cleaved caspase-3蛋白在8周组大鼠心肌组织中呈高表达，明显高于0周组(P<0.05)；在16周组大鼠心肌组织中表达进一步增高，显著高于0周组(P<0.01)(图5,6)。

与0周组比较*P<0.05, **P<0.01图6　各组大鼠心肌组织中GRP78、caspase-12及cleaved caspase-3表达的灰度值分析Figure 6　Grey value of expression of GRP78, cleaved caspase-3 and caspase-12 in myocardial tissues of diabetic rats at different time

3　讨论

近的来随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。临床研究表明，糖尿病患者易发生心衰，Framingham研究显示糖尿病患者心衰的发生率明显升高，其中男性患者增加2-3倍，女性患者较正常人增加5.1倍[8]。糖尿病患者存在左心室肥大、舒张功能合并或不合并收缩功能不全，是易发心衰的重要原因[9]。然而，糖尿病作为独立危险因素，是否直接促进心功能不全尚未完全明确。因此，本研究通过建立糖尿病大鼠模型，造模后8周及16周组大鼠血糖水平显著高于0周组，同时观察了不同时间段的高糖负荷对心肌结构及功能的影响。研究结果显示，8周组大鼠心肌肥厚指标HWI及LVWI稍有升高，但差异尚无统计学意义；而此期大鼠心肌组织已出现排列紊乱及心肌胶原纤维含量增加的病理改变；LVEDP、-dp/dtmax也有明显的降低；表明糖尿病大鼠短期内心肌组织结构已发生较为明显间质纤维化，因此影响心肌的舒张功能，但尚未导致心肌肥厚。16周组大鼠心肌肥厚指标则明显升高，心肌胶原纤维含量增加更为明显，LVP、LVPP及+dp/dtmax明显升高；表明随病程的延长，大鼠心肌间质纤维化更为明显，直接影响了心脏的舒缩功能，且导致心肌肥厚的发生。以上结果提示，高糖可以直接影响大鼠心肌结构及心脏功能，且随时间的延长，心肌间质纤维化程度加重，引起心脏功能的恶化，最终协同导致心肌肥厚。可见在动物模型上，糖尿病作为单独存在的危险因素可直接对心脏造成危害，导致心脏结构的紊乱和功能的下降。我们的结果可能有为助于解释临床上糖尿病患者心衰的发生率明显升高的现象。

高血糖可通过氧化应激、线粒体损伤及炎症反应等多种分子机制对心肌细胞造成危害[10,11]。然而，内质网应激作为多种心血管疾病发生发展的共同分子机制有可能也参与糖尿病心肌病的发生发展[12]。已有研究表明，高糖可能是诱发细胞内质网应激的因素之一[13,14]。内质网是细胞蛋白质合成与正确折叠与的重要场所。多种因素如低氧、高血糖、化学毒物等均可引起未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内积蓄，导致细胞内质网膜表面的保护蛋白GRP78与跨膜蛋白解离来启动传导应激信号而发生应激反应，持久过强的应激激活促凋亡因子caspase-12、CHOP介导的凋亡信号通路，最终导致细胞凋亡[15]。ERS是否也参与了糖尿病心肌病的发生发展尚不清楚。本研究发现，8周组大鼠心肌组织内质网应激保护蛋白GRP78表达较0周组显著增高，促凋亡蛋白caspase-12轻度升高；16周组大鼠心肌组织GRP78表达明显降低，而caspase-12表达持续升高。表明糖尿病早期激活了心肌细胞的ERS，GRP78表达的增高在一定程度上恢复了内质网稳态，维持了细胞存活；随着糖尿病的持续存在，稳态调节反应逐渐减弱，ERS启动凋亡信号通路，促凋亡因子caspase-12表达增高介导了细胞凋亡。凋亡执行蛋白cleaved caspase-3的随应激时间的延长表达渐增进一步印证了凋亡通路的激活。以上研究结果提示，糖尿病早期诱导了大鼠心肌细胞ERS；随应激时间的延长，激活了ERS介导的凋亡信号通路；凋亡信号通路的激活可能是高糖所致心肌结构纤维化的分子机制之一，有助于解释糖尿病大鼠心肌功能的改变。

综上所述，高血糖可能诱导了大鼠心肌细胞ERS，持续的应激导致相关因子GRP78和caspase-12表达失衡，促凋亡因子caspase-12过表达激活了细胞凋亡通路，以上ERS相关因子表达的变化可能是导致心肌结构和功能改变的分子机制之一。

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Expression of endoplasmic reticulum stress-related GRP78 and caspase-12 in myocardial tissue of diabetic rats and its effect on cardiac structure and function

YANG Jingxiao1, CHEN Jingyuan2, WANG Zikuan1*

(1DepartmentofCardiology,TangduHospital,FourthMilitaryUniversity,Xi’an710038,China;2DepartmentofOutpatient,RocketForcesEngineeringUniversity；*Correspondingauthor，Email：Wangzikuan@sohu.com)

ObjectiveTo investigate the expression of endoplasmic reticulum stress(ERS)-related GRP78 and caspase-12 in myocardial tissues of diabetic rats, and explore the effect of ERS on cardiac structure and function.MethodsFifteen diabetic rat models were induced by streptozotocin(STZ) and then randomly divided into 0 week group, 8 weeks group, and 16 weeks group. Blood pressure, heart rate and myocardial function were measured by carotid artery intubation indicator. Heart weight to body weight ratio(HWI), left ventricular weight to whole heart weight(LVWI) were calculated, and collagenous fiber was observed by Masson staining. The expression levels of GRP78, caspase-12 and cleaved caspase-3 in rat myocardial tissues were measured.ResultsCompared with 0 week group, left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP) and-dp/dtmax were increased in 8 weeks group(P<0.05) and 16 weeks group(P<0.01). Compared with 0 week group, HWI and LVWI were increased in 16 weeks group(P<0.05). Collagenous fiber was slight, whereas it was increased in 8 weeks group. Compared with 0 week group, the expression of GRP78 significantly up-regulated in 8 weeks group(P<0.01), but down-regulated in 16 weeks group(P<0.05). The expression of caspase-12 and cleaved caspase-3 were markedly increased in 8 weeks and 16 weeks group(P<0.05).ConclusionHyperglycemia could exert a direct effect on heart in rats. In the early stage of hyperglycemia, the expression of GRP78 protein is up-regulated, and the expression of caspase-12 and cleaved caspase-3 is also significantly up-regulated as the stress is enlarged. The ERS of myocardial tissues could be one of the reasons of the changes of cardiac structure and function in diabetic rats.

diabetes;endoplasmic reticulum stress;cardiac structure；GRP78;caspase-12;rats

杨竞霄，女，1975-05生，硕士，主治医师，E-mail：1229217173@qq.com

2016-04-19

R587.1

A

1007-6611(2016)08-0679-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.001