响应面法优化怀菊水溶性总多酚的超声提取工艺

樊燕鸽,张娟梅,黄做华

(1.河南大学药学院,河南开封 475004;2. 河南省科学院化学研究所有限公司,河南郑州 450002)



响应面法优化怀菊水溶性总多酚的超声提取工艺

樊燕鸽1,2,张娟梅1,*,黄做华2

(1.河南大学药学院,河南开封 475004;2. 河南省科学院化学研究所有限公司,河南郑州 450002)

对怀菊中水溶性总多酚的超声辅助提取工艺进行了优化。以水作提取剂,在单因素实验的基础上选择超声功率、超声时间、液料比3个因素为自变量,以怀菊中总多酚的得率为响应值,进行中心组合设计(CCD),采用响应面法优化了怀菊总多酚的提取工艺。结果表明,超声辅助提取怀菊中总多酚的最佳工艺条件为:超声功率225 W,超声处理时间为40 min,液料比23.5∶1(mL/g)。在此工艺条件下,总多酚的得率高达76.53 mg/g。该实验结果能够为怀菊中水溶性多酚提取工艺的进一步放大提供科学依据和理论参考。

怀菊,总多酚,响应面法,中心组合设计(CCD),超声提取

花茶作为一种传统饮品在我国已有两千多年的历史。近年来,随着人们保健与养生意识的不断增强,可作花茶饮用的各种天然药食同源植物的花卉备受青睐。怀菊属于白菊花的一种,为怀川四大怀药之一,是我国著名的道地药材,主产于河南焦作地区(武陟、温县、博爱一带),具有散风清热,平肝明目等功效,是极佳的药用菊花[1]。怀菊的活性成分主要有黄酮类、多酚类、挥发油等[2-3],怀菊中黄酮类和挥发油的研究已有大量报道[4-7],但针对其水提多酚类物质的研究尚不多见。多酚是一类广泛存在于植物体内的多元酚类化合物,属于一种非营养性生物剂,是一种良好的抗氧化剂,对能引起生物组织膜因产生过氧化作用而导致结构和功能损伤的过氧自由基(RO2·)、羟自由基(OH·)等自由基有明显的清除作用,在保护人体不受自由基所致的氧化损伤方面有着十分重要的作用[8-9]。怀菊的生物学效应与其所含的多酚类物质密切相关。

前人对中草药药效成分的提取多以乙醇作为提取剂[4,7,10-12],本文以水作提取剂旨在获得怀菊中的水溶性多酚,可为进一步考察怀菊花茶的生理功能奠定基础。另一方面,超声波能引起空化等一系列的特殊效应,具有辅助萃取植物有效成分的功能,可有效提高萃取效率[13-14]。本文采用超声辅助提取技术提取怀菊中的水溶性总多酚,并采用响应面法优化提取条件,旨在为怀菊的工业化深加工和质量控制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

怀菊河南省焦作市怀达怀药有限公司,105 ℃烘干后磨碎,置于干燥器中保存,备用;没食子酸标准品大连美仑生物技术有限公司;福林酚、无水乙醇、无水碳酸钠均为分析纯。

VGT-2227QTD数控式超声波萃取设备深圳固特宏业机械设备有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅江苏省金坛市友联仪器研究所;R-205型旋转蒸发仪上海申顺生物科技有限公司;BAO-80型精密鼓风干燥箱上海施都海仪器设备有限公司;Alpha-1101型可见分光光度计上海谱元仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1怀菊提取物的制备称取5.0000 g怀菊粉末,按照20∶1(mL/g)的液料比加入去离子水后置于超声萃取罐中提取30 min,取滤液再于12000 r/min条件下离心20 min,得澄清提取液。收集上清,旋转蒸发至渐干,再以5 mL去离子水复溶。复溶后的样品于真空冷冻干燥机中冻干后称重,计算得率。所得样品密封后置于-20 ℃保藏,备用。怀菊提取物得率(D)的计算公式如下:

1.2.2怀菊提取物中总多酚含量及得率的测定本文参照已有文献[15],采用福林-酚法测定怀菊提取物中总多酚的含量。精确称取没食子酸标准品,配成2.0000 mg/mL的样品母液,稀释得到0.0125、0.0250、0.0500、0.1000、0.2000 mg/mL的系列浓度(Nki),再分别吸取1 mL稀释后的样品于25 mL棕色容量瓶中,加入2.5 mL配制好的福林-酚试剂和12 mL去离子水,放置1 min后,加入7.5%的Na2CO3溶液5 mL,定容后室温下反应1 h。同时,用1 mL去离子水代替标准样品作为空白对照,反应完成后在760 nm波长下测定各个吸光度(Aki),绘制标准曲线。称取一定量粉末状的怀菊提取物,配制成2.0000 mg/mL的待测样品母液,测定时将样品稀释到0.2000 mg/mL,再吸取1 mL稀释后的样品于25 mL棕色容量瓶中,然后与按照标准溶液同样的方法,在760 nm波长下测定其吸光度(As)。怀菊提取物中总多酚的没食子酸当量浓度(Nd)按下式计算:

式中,0.2000表示被测样品的终浓度为0.2000 mg/mL;1表示被测样品的取样量为1 mL;式中,Aki和Nki之间的关系可以通过建立回归方程来确定。

该法制备怀菊中水溶性总多酚的得率可按下式计算:

总多酚得率(%)=Nd×D

式中,Nd表示怀菊提取物中总多酚的当量浓度;D表示怀菊提取物的得率。

1.2.3怀菊总多酚提取的单因素实验

1.2.3.1超声功率对怀菊总多酚得率的影响称取5.0000 g怀菊粉末,按照25∶1(mL/g)的液料比加入去离子水,在超声时间为60 min的条件下,分别选取50、150、250、350、450 W的超声功率,按照方法1.2.1进行多酚提取,计算提取物中多酚的含量与得率,考查超声功率对总多酚得率的影响。每份样品做三个平行,测定结果取平均。

1.2.3.2超声处理时间对怀菊总多酚得率的影响称取5.0000 g怀菊粉末,按照25∶1(mL/g)的液料比加入去离子水,在超声功率为250 W的条件下,分别选取20、40、60、80、100、120 min六个时间点来考查超声处理时间对怀菊总酚得率的影响。按照方法1.2.1进行多酚提取,每份样品做三个平行。

1.2.3.3液料比对怀菊总多酚得率的影响称取5.0000 g怀菊粉末,在超声功率200 W、超声时间60 min的条件下,分别选取5∶1、15∶1、25∶1、35∶1、45∶1(mL/g)的液料比,按照方法1.2.1进行多酚提取。计算总多酚得率,考查液料比对怀菊总多酚得率的影响。每份样品做三个平行,测定结果取平均。

1.2.4响应曲面法优化怀菊总多酚的超声提取工艺在单因素实验的基础上,选取超声功率、超声提取时间和液料比三个因素为考查对象,应用Design export 7.0 数据处理软件的Central Composite Design(CCD)工具设计实验方案,实验次数为20次,实验设计的因素水平见表1。

表1　中心点法实验设计的因素水平表Table 1　Corresponding actual values of the factors tested in central-composite design

注:alpha=1.68179。

1.3数据统计分析

本文所得数据均为平行测定3次以上取平均值,并计算出正负标准偏差,用误差线表示。采用Design export 7.0 数据处理软件对实验结果进行处理,应用中心点法对各组变量的计算结果进行方差分析和差异显著性分析,p<0.05表明分析结果的差异性显著。

2　结果与讨论

2.1总多酚测定的标准曲线

以没食子酸标准液浓度为横坐标,测得的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线(图1)。

图1　多酚测定的标准曲线Fig.1　The standard curve of polyphenol content determine

由图1可见,没食子酸浓度在0.0125～0.2000 mg/mL的梯度范围内,其浓度与吸光度具有良好的线性关系,所得回归方程的R2值高达0.9995。因此,该方程准确有效,可用作样品中多酚含量测定的工作曲线。

2.2怀菊总多酚超声提取的单因素实验

2.2.1超声功率对怀菊总多酚得率的影响5种不同的超声功率对怀菊总多酚得率的影响见图2。

图2　超声功率对总多酚得率的影响Fig.2　Effect of ultrasound power on the yield of polyphenols

由图2可见,怀菊中多酚的得率随着超声功率的增加先增大再减小。超声功率为250 W时,总多酚的得率最大,但当功率增加到350 W以后,总多酚的得率不仅没有增加反而略有降低。这可能是由于较大的超声功率虽有利于加快植物组织中多酚的溶出,然而当功率增加到一定程度后,过大的超声功率所引起的热效应会造成组织蛋白变性,从而阻碍了多酚的溶出。所以,选择250 W的超声功率为佳。

2.2.2超声处理时间对怀菊总多酚得率的影响6种不同的超声处理时间对怀菊中总多酚得率的影响结果见图3。

图3　超声时间对总多酚得率的影响Fig. 3　Effect of ultrasound time on the yield of polyphenols

由图3可看出,怀菊中总多酚的得率随着超声提取时间的延长先增大再减小,这可能是由于超声时间越长,对植物组织的破坏力越大,越利于多酚的溶出。然而,当超声时间增加到60 min后,总多酚的提取得率反而开始下降,这可能是由于超声时间过长,使得提取液的温度升高过多,一方面物料受热不利于植物组织中多酚的溶出,另一方面也可使溶出的多酚类化合物因高温下长时间作用而被破坏。本文选择40 min作为最佳的提取时间。

2.2.3液料比对怀菊中总多酚得率的影响考查5种不同的液料比对怀菊总多酚提取得率的影响,结果见图4。

图4　液料比对总多酚得率的影响Fig.4　Effect of liquid-to-solid rate on the yield of polyphenols

由图4可见,当液料比小于25∶1(mL/g)时,怀菊中总多酚的提取得率随着液料比的增大而增大,但当液料比超过25∶1(mL/g)后,总多酚的得率不再随液料比的增加而增大。由于生产中使用的提取剂后期处理与回收均较为繁杂,高的液料比势必增加后期处理的负担,所以液料比的选择也不宜过高,25∶1(mL/g)是较好的选择。

2.3超声辅助提取怀菊中总多酚的工艺优化

根据单因素实验结果,对选取的3个影响因子(超声功率、超声处理时间和液料比)分别从5个水平(-alpha,-1,0,1,+alpha)进行考查,应用Design Export设计软件的中心组合设计(CCD)方法,得出20组实验的设计方案,按照各组实验给定的工艺条件进行怀菊总多酚的提取,计算总多酚得率,结果见表2。以总多酚得率为考查依据,建立响应曲面模型,并对所建立的模型进行显著性分析,结果见表3。

利用Design Export 7.0.0软件对实验结果进行分析,可以得到总多酚得率的拟合一阶模型,其回归方程:Y=72.32+4.51A+2.93B+2.45C+0.46AB-1.48AC-1.29BC-3.15A2-3.69B2-1.28C2,R2=0.9459。说明该模型能够很好地拟合各因素组合对多酚提取得率的影响。

由表3可见,所建立模型的F值为19.41,p值小于0.0001,表明该模型极显著。由各项的p值可以看出,该模型中,A,B,C,A2,B2,均为极显著项(p<0.01),AC,AB,BC为不显著项(p>0.05)。失拟项的p值为0.8215,大于0.05,表明失拟项所带来的绝对偏差不显著,这表明所建立的模型是切实有效的。用响应曲面的3D图来反映各因素两两之间的交互作用,结果见图5～图7。

表2　怀菊总多酚的超声辅助提取工艺条件优化的 实验方案及结果Table 2　Experiment design of optimizing the total polyphenol extraction process conditions

表3　中心点法实验设计的 多元回归模型系数评估及其显著性检验Table 3　Regression coefficients estimation and their significance test for the quadratic polynomial model of CCD

注:*p<0.05,差异显著;**p<0.01,差异极显著。

图5　超声时间和超声功率 对总多酚得率影响的响应曲面图Fig.5　Response surface plots showing the effect of ultrasound time and power affected yield of polyphenol

图6　液料比和超声功率对总多酚得率影响的响应曲面图Fig.6　Response surface plots showing the effect of liquid-to-solid and power affected yield of polyphenol

图7　液料比和超声时间对总多酚得率影响的响应曲面图Fig.7　Response surface plots and contours showing the effect of liquid-to-solid and ultrasound time affected yield of polyphenol

通常情况下,响应曲面的等高线图中等高线的形状能够直观地反映出两因素交互作用的强弱[16]。一般而言,等高线呈椭圆形表示两因素的交互作用是显著的,椭圆的两焦距越大表明越显著,焦距越小则越不显著。若椭圆形的焦距为零,则等高线呈正圆形,表明两因素之间没有交互作用,或交互作用不显著,可以忽略不计[17]。由图5～图7可见,超声功率和超声提取时间之间交互作用的等高线最趋于正圆形,表明二者之间无明显交互作用。

在以上数据分析的基础上,运用Design Export 7.0.0软件的Point Prediction工具预测结果得出,以水作提取剂,怀菊总多酚提取的最优工艺条件为:超声功率为225 W,超声处理时间为40 min,液料比23.5∶1(mL/g),预测该工艺条件下的平均得率为77.55 mg/g。

2.4模型的验证

根据模型预测结果进行近似验证实验,工艺条件为:超声功率为225 W、超声处理时间为40 min、液料比23.5∶1(mL/g),测得总多酚的得率为76.53 mg/g,与回归方程所得预测值77.55 mg/g的误差为1.31%。这表明该回归方程能够真实地反映各因素对水溶性怀菊总多酚得率的影响,也表明响应面法可用于该提取工艺的研究。

3　结论

响应面分析法可用于超声辅助水提怀菊中总多酚的工艺条件研究,在单因素实验的基础上,采用中心组合实验设计(CCD)对提取工艺进行优化,并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验,优化了内在因素水平,探讨了各因素间的交互作用,并对实验结果进行数学模拟和预测,从而以最经济的方式高效、准确地得到优化条件。优化后的工艺条件为:超声功率为225 W,超声处理时间为40 min,液料比23.5∶1(mL/g)。在此工艺条件下,总多酚的得率为76.53 mg/g。该实验结果能够为怀菊中水溶性多酚提取工艺的进一步放大提供科学依据和理论参考,具有一定的理论价值和实际应用前景。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total polyphenols from huai chrysanthemum by response surface analysis

FAN Yan-ge1,2,ZHANG Juan-mei1,*,HUANG Zuo-hua2

(1.Pharmaceutical College of Henan University,Kaifeng 475004,China;2. Institute of Chemistry Co. Ltd.,Henan Academy of Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Response surface methodology was applied to optimize ultrasonic-assisted extraction process of total polyphenols from huai chrysanthemum based on single experiments. Ultrasonic power,extraction times and ratio of solid and liquid were selected for central composite design(CCD). The response surface method was used to optimize the huai chrysanthemum the extraction process of total polyphenols. The results indicated that the optimal process conditions were as followings:ultrasonic power was 225 W,extraction time was 40 min,the ratio of liquid and solid was 23.5∶1(mL/g). Under these optimized conditions,the yield of total polyphenols was up to 76.53 mg/g. These researches provided some useful and valid reference for the further study of huai chrysanthemum.

huai chrysanthemum;total polyphenols;response surface methodology;central composite design(CCD);ultrasonic extraction

2015-08-07

樊燕鸽(1979-),女,硕士研究生,助理研究员,研究方向:天然产物与药物化学,E-mail:fblues@163.com。

张娟梅(1981-),女,博士,讲师,研究方向:食品营养与安全,E-mail:zjmwrn@163.com。

TS201.2

B

1002-0306(2016)05-0268-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.044