多重胁迫对嗜盐四联球菌CGMCC 3792存活率及细胞成分的影响

何桂强,冯　笑,吴重德,黄　钧,周荣清

(四川大学轻纺与食品学院,皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都 610065)



多重胁迫对嗜盐四联球菌CGMCC 3792存活率及细胞成分的影响

何桂强,冯笑,吴重德*,黄钧,周荣清

(四川大学轻纺与食品学院,皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都 610065)

本研究以嗜盐四联球菌(TetragenococcushalophilusCGMCC 3792)为实验菌株,考察了单因素(酸、热、盐)胁迫和交互保护对其存活的影响。结果表明,T.halophilusCGMCC 3792在pH4.0和45 ℃预适应处理60 min后细胞对酸致死胁迫(pH2.5,60 min)的存活率分别提高了10.6倍和8.8倍。此外,还考察了酸胁迫对细胞膜不饱和脂肪酸和胞内氨基酸含量的影响,结果表明,酸预适应后再经酸致死胁迫导致细胞膜不饱和脂肪酸18∶1n-9和18∶2n-6,9含量增加,分别是直接经酸致死胁迫的2.3倍和2.0倍;同时,分析胞内氨基酸含量,胞内谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度分别是直接经酸致死胁迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。研究结果将有助于进一步解析嗜盐四联球菌环境胁迫抗性的生理机制。

嗜盐四联球菌,环境胁迫,交互保护,膜脂肪酸,胞内氨基酸

嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)的代谢产物乳酸等小分子有机酸,不仅能通过缩合反应与醇类产生酯类组分,赋予产品独特的风味,而且能使体系的pH降低抑制有害微生物,如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等的生长[1-2]。因此,嗜盐四联球菌已广泛应用于高盐发酵调味品(酱油、鱼露、豆酱)[3-5]的生产中。不同类型发酵调味品生产中,其盐分、酸度、溶氧等参数控制有较大差异,波动范围也不同。多重因素影响着T.halophilus的正常生理代谢,致使其难以充分发挥作用。由此可见,提高其对环境胁迫的抗性,具有重要意义。

目前对于提高微生物对环境胁迫抗性的策略主要有:一是从胁迫环境中直接筛选耐受菌株;二是根据微生物胁迫机理的研究定向改造微生物菌种,从而提高其耐受性[6]。然而在实际生产中,微生物所遇到的环境胁迫是复杂和交叉的,往往同时出现。因此,通过直接筛选的方法容易漏掉一些有应用潜力的耐受菌株,而对胁迫机理的研究却逐渐成熟并为筛选耐受菌株提供了新的思路。Zhang等[7]发现在酸胁迫条件下干酪乳杆菌进化菌株比原始菌株积累更多的精氨酸,并通过外源添加精氨酸至L.casei酸胁迫培养基中,L.casei存活率显著提高。已有的研究表明微生物经一种环境胁迫后对其他多种环境胁迫的抗性显著提高,这种现象被称为“交互保护”。交互保护作为细胞对环境胁迫中的一种应激反应,在提高微生物对环境胁迫的耐受性方面具有重要作用。薛峰等[8]研究了不同预适应条件对干酪乳杆菌ATCC393TM存活的影响,其中经pH4.0的盐酸预适应90 min后,干酪乳杆菌ATCC393TM对热胁迫(70 ℃,90 min)和氧胁迫(10 mol/L H2O2,90 min)的存活率分别提高了305倍和173倍。

本文以T.halophilusCGMCC 3792为研究对象,研究其在单因素胁迫和交互胁迫过程中细胞存活率的变化,并对细胞膜不饱和脂肪酸和胞内氨基酸进行了分析,旨在为提高其环境胁迫抗性以及工业应用奠定了理论基础。

表1　单因素胁迫种类和胁迫条件Table 1　Types and conditions of stress in single-factor experiment

1　材料与方法

1.1材料与仪器

嗜盐四联球菌(T.halophilusCGMCC 3792),实验室从酱油醪中分离,经形态、生理生化特性实验和16S rDNA测序鉴定,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

M17肉汤购于OXOID公司。种子培养基:M17肉汤,加入6% NaCl,补充终浓度为5 g/L的葡萄糖。胁迫培养基:M17肉汤,补充终浓度为5 g/L的葡萄糖,分别加入不同浓度的NaCl或盐酸调节培养基的盐浓度和pH。其他化学试剂均为分析纯。

可见光分光光度计(Spectrumlab22PC)美国PerkinElmer公司;高速冷冻离心机(GL-20G-C)上海安亭科学仪器有限公;气相色谱-质谱联用仪(Trace DSQ II)美国Thermo公司;氨基酸分析仪(A300)德国默曼博尔公司。

1.2单因素胁迫实验

先将种子培养液活化,然后以5%接种量接入M17培养基中,在30 ℃条件下静置培养至OD600值为2.5时,取1 mL培养物离心(10000×g,4 ℃,5 min),然后用无菌生理盐水离心洗涤两次,收集菌体重悬于等体积的胁迫培养基中(表1)。胁迫后的细胞用无菌生理盐水离心洗涤后,稀释成不同梯度,取10 μL稀释液点种于M17平板中并进行菌落计数。

1.3交互保护实验

依据1.2单因素胁迫实验收集菌体,将菌体分别重悬在三种胁迫种类的预适应(pH4.0,60 min;45 ℃,60 min和6% NaCl,60 min)培养基中,预适应后的细胞用无菌生理盐水离心洗涤两次,分别得到各预适应条件处理后的细胞,稀释成不同梯度后取10 μL重悬液点种于M17培养基平板中并进行菌落计数。依据上述预适应处理后的菌体细胞在三种致死胁迫条件(pH2.5,60 min;55 ℃,60 min和36% NaCl,120 min)下进行处理,以前述方法点种于M17培养基平板中并计数。

1.4细胞存活率的计算

取10 μL菌液以不同稀释度点种于M17培养基平板上测定单位体积菌落数(colony forming per unit,CFU/mL)。每个稀释梯度均设3个平板为平行,将平板放置在30 ℃下培养36 h,计数菌落数。以pH6.8、30 ℃和0% NaCl处理得到的菌落数为100%的存活率,经酸、热和盐不同条件胁迫得到的菌落数分别与pH6.8、30 ℃和0% NaCl处理得到的菌落数之比即为不同条件胁迫的存活率。

1.5细胞膜脂肪酸成分的分析

分别取25 mL OD600为2.5的培养液依据1.2收集菌体,将菌体酸预适应处理(pH4.0,60 min)后,进行酸致死胁迫(pH2.5,60 min),测定干重(dry weight,DW)。细胞膜脂肪酸的提取和检测参考文献[9]。C9-C20的脂肪酸可根据各自的保留时间和质谱范围在图库中进行查找,每个样品重复测定3次。

1.6胞内氨基酸含量测定

取10 mL OD600值为2.5的培养液依据1.2收集菌体,将菌体酸预适应处理(pH4.0,60 min)后,进行酸致死胁迫(pH2.5,60 min),然后用无菌生理盐水离心洗涤两次,重悬于1 mL的50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)中,置于沸水中煮沸15 min,离心(10000×g,4 ℃,10 min),取上清液。在上清液中加入100 μL 10%的磺基水杨酸,沉淀蛋白,然后经0.22 μm过滤器过滤后,用氨基酸分析仪测定,测定条件参考文献[10]。细胞中游离氨基酸浓度由标准氨基酸校正计算。

1.7数据分析

本实验的数据分析与制图采用Origin 8.5,显著性分析则采用SPSS 19.0进行。所有结果均有三次平行实验。

图1　酸胁迫(A)、热胁迫(B)和盐胁迫(C) 对嗜盐四联球菌CGMCC 3792存活率的影响Fig.1　Effect of acid(A),heat(B),and salt(C)stresses on the survival of T. halophilus CGMCC 3792

2　结果与讨论

2.1单因素胁迫对菌株CGMCC 3792存活率的影响

pH、温度、盐浓度对T.halophilusCGMCC 3792存活的影响如图1所示。pH在3.0～6.8的范围时,pH降低使细胞存活率小幅度减少;然而,当pH从3.0降低到2.5时,其存活率从67.5%显著降低到6.17%(图1A)。温度在30～40 ℃范围变化时,对细胞存活率的影响较小,继续提高热处理温度时,显著影响其存活率,55 ℃时,存活率降至3.51%(图1B)。在0%～36% NaCl浓度范围内,随其浓度增加,细胞存活率呈现下降的趋势;但在36%NaCl盐胁迫处理120 min后,其存活率仍在10%以上(图1C)。

综上所述,分别选取pH4.0、45 ℃和6% NaCl浓度处理60 min作为T.halophilusCGMCC 3792的酸、热和盐预适应条件;而pH2.5、55 ℃处理60 min和36% NaCl浓度处理120 min分别作为酸、热和盐胁迫的致死条件。

2.2交互保护对菌株CGMCC 3792存活率的影响

分别考察了细胞经预适应处理后再经致死胁迫的存活率变化。图2为细胞分别经pH4.5、45 ℃和6% NaCl预适应处理60 min后,再经酸致死(pH2.5,60 min)、热致死(55 ℃,60 min)和盐致死(36% NaCl,120 min)胁迫,存活率的增加倍数。

图2　预适应处理后嗜盐四联球菌CGMCC 3792 在酸(A)、热(B)和盐(C)致死条件下的存活率变化Fig.2　Survival rate of T. halophilus CGMCC 3792 under lethal acid(A),heat(B),and salt(C)stress after pre-adaptation注:图柱上方星号表示与对照(不预适应) 比较具有显著性差异(p<0.05)。

在酸致死胁迫中,与未经预适应的细胞相比,经酸、热和盐预适应处理后,细胞存活率分别提高了10.6倍、8.8倍和1.5倍(图2A)。酸适应性反应是乳酸菌中常见的一种应激反应,酸预适应后,能诱导细胞的酸耐受反应机制,从而提高细胞在酸胁迫环境下的存活率。Hartke等[11]报道,乳酸乳球菌乳亚种细胞在pH5.5酸预处理30 min后,再经pH3.9的致死酸胁迫处理,其存活率比未经预适应的细胞显著提高。在热致死胁迫中,经热和盐预适应后,细胞存活率分别提高了2.3倍和2.1倍,而经酸预适应处理的细胞存活率与对照相比不增反降(图2B)。盐预适应处理后,细胞存活率提高可能与蛋白表达有关。有研究表明,L.lactis在遭遇盐胁迫时,12种上调蛋白质都属于热胁迫应激蛋白[12]。此外,考察了预适应后对热致死胁迫细胞存活率的变化,结果表明,经酸、热和盐预适应处理后,细胞存活率分别提高了2.2倍、3.0倍和2.3倍(图2C)。热预适应后,存活率的提高与热胁迫应激蛋白密切相关。Broadbent等[13]曾报道了L.helveticusLH212在52 ℃预适应处理20 min后,再经历63 ℃致死胁迫时与未经预适应处理的相比,细胞存活率提高了11倍,通过二维凝胶电泳分析,还检测到了一些热胁迫应激蛋白DnaK,GroEL,ClpB,GrpE,使细胞的耐热性增强。

图3　酸胁迫对细胞膜脂肪酸含量的影响Fig.3　Effect of acid stresson membrane fatty acids distribution.(A)saturated fatty acids, (B)unsaturated fatty acids 注:图柱上方星号表示与对照(胁迫前) 比较具有显著性差异(p<0.05)，图4同。

2.3酸胁迫对细胞膜脂肪酸组分的影响

图3所示为酸胁迫对细胞膜脂肪酸组分的影响。由图可知,酸胁迫后,饱和脂肪酸含量(14∶0,15∶0,16∶0和20∶0)有所降低(图3A);但是,与胁迫前相比的不饱和脂肪酸含量(18∶1n-9和18∶2n-6,9)在酸预适应后增加,直接经酸致死胁迫后进一步增加(图3B)。特别的是,经过酸预适应再经酸致死胁迫的不饱和脂肪酸含量(18∶1n-9和18∶2n-6,9)显著增加,分别是直接经酸致死胁迫的2.3倍和2.0倍。调节细胞膜脂肪酸分布是细胞抵御环境胁迫的重要机制之一,细胞可以通过改变脂肪酸的组分来适应环境胁迫[14]。通过考察酸胁迫对细胞膜脂肪酸含量的变化得知,酸胁迫后引起饱和脂肪酸含量降低,而不饱和脂肪酸含量显著升高,这与酸胁迫引起干酪乳杆菌细胞膜饱和脂肪酸(C14∶0,C15∶0,C16∶0)比例降低,而不饱和脂肪酸18∶1n-9和18∶1n-11都有不同程度的增加结果是一致的[15]。结果表明,增加不饱和脂肪酸含量是嗜盐四联球菌的一种酸存活机制。

2.4酸胁迫对胞内氨基酸含量的影响

酸胁迫对嗜盐四联球菌胞内氨基酸含量的影响,如图4所示。酸预适应后,谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸含量降低幅度小;但是酸胁迫后,含量显著降低,分别仅为胁迫前的20.8%、21.2%、15.3%和18.3%。特别的是,经过酸预适应后再应对酸致死胁迫的胞内氨基酸含量分别是直接经历酸致死胁迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。

图4　酸胁迫对胞内氨基酸含量的影响Fig.4　Effect of acid stress on intracellular pools of amino acid

在谷氨酸脱羧酶途径中,脱羧反应不仅可以消耗胞内的H+,而且生成碱性略强的γ-氨基丁酸,因此,谷氨酸的积累能够很好地阻止细胞内的pH降低,维持稳定的pH范围[16]。此外,脱羧反应与电子传递的偶合可产生ATP及质子推动力也有利于细胞的存活。有研究报道,在外源添加天冬氨酸可以使L.casei在酸胁迫条件下(pH4.3)的生长性能和存活率显著增加[17],表明酸胁迫条件下积累天冬氨酸含量可以提高细胞的酸耐受性能。亮氨酸和异亮氨酸作为支链氨基酸在胞内的积累是乳酸菌常见的一种酸应激反应[17],这是因为支链氨基酸的合成需要消耗丙酮酸和NADH,同时减少甲酸的含量,使胞内酸性减弱。因此,支链氨基酸的脱氨作用被认为是维持胞内pH稳定的一种机制[18]。

3　结论

本研究通过考察了嗜盐四联球菌在单因素胁迫和交互胁迫过程中细胞存活率的变化,并对酸胁迫处理后的细胞膜脂肪酸和胞内氨基酸进行了分析。研究发现,酸预适应处理与未经预适应的细胞相比,其在应对酸致死胁迫时存活率提高了10.6倍(图2)。酸预适应后再经历酸致死胁迫与直接经历酸致死胁迫相比,细胞膜不饱和脂肪酸(18∶1n-9和18∶2n-6,9)和胞内氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)含量更高,可以提高其酸耐受性。上述研究结果有助于进一步认识嗜盐四联球菌抵抗环境胁迫的生理机制。

[1]Wu C,Liu C,He G,et al. Characterization of a multiple-stress tolerance Tetragenococcus halophilus and application as starter culture in Chinese Horsebean-Chili-Paste manufacture for quality improvement[J]. Food Science and Technology Research,2013,19(5):855-864.

[2]Onda T,Yanagida F,Uchimura T,et al. Widespread distribution of the bacteriocin-producing lactic acid cocci in miso-paste products[J]. Journal of Applied Microbiology,2002,92(4):695-705.

[3]Fukami K,Funatsu Y,Kawasaki K,et al. Improvement of fish-sauce odor by treatment with bacteria isolated from the fish-sauce mush(moromi)made from frigate mackerel[J]. Journal of Food Science,2004,69(2):45-49.

[4]Udomsil N,Rodtong S,Choi Y,et al. Use ofTetragenococcushalophilusas a starter culture for flavor improvement in fish sauce fermentation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(15):8401-8408.

[5]Tanaka Y,Watanabe J,Mogi Y. Monitoring of the microbial communities involved in the soy sauce manufacturing process by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Food Microbiology,2012,31(1):100-106.

[6]Carvalho A,Cardoso S,Bohn A,et al. Engineering trehalose synthesis inLactococcuslactisfor improved stress tolerance[J]. Applied and Environmental Microbiology,2011,77(12):4189-4199.

[7]Zhang J,Wu C,Du G,et al. Enhanced acid tolerance inLactobacilluscaseiby adaptive evolution and compared stress response during acid stress[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2012,17(2):283-289.

[8]薛峰,张娟,堵国成,等.交互保护对干酪乳杆菌ATCC 393TM存活的影响[J]. 微生物学报,2010,50(4):478-484.

[9]刘琨毅,卢中明,郑佳,等.浓香型白酒窖泥微生物群落PLFA指纹图谱方法[J]. 应用与环境生物学报,2012,18(5):831-837.

[10]Cui R,Zheng J,Wu C,et al.Effect of different halophilic microbial fermentation patterns on the volatile compound profiles and sensory properties of soy sauce moromi[J]. European Food Research and Technology,2014:1-11.

[11]Hartke A,Bouche S,Giard J,et al. The lactic acid stress response ofLactococcuslactissubsp[J]. Current Microbiology,1996,33(3):194-199.

[12]Kilstrup M,Jacobsen S,Hammer K,et al. Induction of heat shock proteins DnaK,GroEL,and GroES by salt stress inLactococcuslactis[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997,63(5):1826-1837.

[13]Broadbent J,Ober C,Wang H,et al. Attributes of the heat shock response in three species of dairyLactobacillus[J]. Systematic and Applied Microbiology,1997,20(1):12-19.

[14]Denich T,Beaudette L,Lee H,et al. Effect of selected environmental and physico-chemical factors on bacterial cytoplasmic membranes[J]. Journal of Microbiological Methods,2003,52(2):149-182.

[15]Wu C,Zhang J,Wang M,et al.Lactobacilluscaseicombats acid stress by maintaining cell membrane functionality[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2012,39(7):1031-1039.

[16]Higuchi T,Hayashi H,Abe K. Exchange of glutamate and gamma-aminobutyrate in aLactobacillusstrain[J]. Journal of Bacteriology,1997,179(10):3362-3364.

[17]Wu C,Zhang J,Du G,et al. Aspartate protectsLactobacilluscaseiagainst acid stress[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(9):4083-4093.

[18]Len A,Harty D,Jacques N. Proteome analysis of Streptococcus mutans metabolic phenotype during acid tolerance[J]. Microbiology,2004,150(5):1353-1366.

Influence of multiple stresses on the survival and cellar constituent ofTetragenococcushalophilusCGMCC 3792

HE Gui-qiang,FENG Xiao,WU Chong-de*,HUANG Jun,ZHOU Rong-qing

(College of Light Industry,Textile & Food Engineering,and Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering,Ministry of Education,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

In this study,the influence ofsingle-stress(acid,heat,or salt)and cross-protection on the survival ofTetragenococcushalophilusCGMCC 3792 was investigated. The results indicated that cells were pre-adapted at pH4.0 or 45 ℃ for 60 min,and then acid challenged at pH2.5 for 60 min,and the survival rate increased 10.6-fold and 8.8-fold,respectively. Analysis of membrane fatty acids and intracellular amino acids in acid-adapted cells showed that unsaturated fatty acids18∶1n-9 and 18∶2n-6,9 were 2.3-fold and 2.0-fold higher than that in cells directly subjected to lethal acid stress,respectively. In addition,the intracellular concentrations of glutamate,aspartate,leucine,and isoleucinewere 2.5-fold,2.4-fold,2.2-fold and 2.7-fold higher than those in control cells,respectively. Results presented in this study may contribute to further elucidate the physiological mechanisms employed byT.halophilusduring environmental stresses.

T.halophilus;environmental stresses;cross-protection;membrane fatty acid;intracellular amino acid

2015-08-04

何桂强(1990-)，男，硕士研究生，研究方向：微生物生理学与生物化学，E-mail:guiqianghe@163.com。

吴重德(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物生理学与生物化学，E-mail:wuchongde@163.com。

国家自然科学基金(31301546);中央高校基本科研业务费专项资金(SCU2015D008)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.027